【摘 要】
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侵袭性真菌感染已成为公共卫生领域的重大威胁,白色念珠菌感染在临床上表现十分严峻,感染而引起的死亡率高。目前,临床上常用的唑类药物治疗白色念珠菌,白色念珠菌对药物耐药性的出现使得现有治疗方案的治疗效果不断降低。降低白色念珠的耐药性以及寻找新的治疗策略是控制白色念珠菌感染的关键。研究表明,白色念珠菌HDA1蛋白是一个重要的药物靶点,HDA1与白念珠菌的菌丝形态转变,白色—不透明型过渡等毒力特征有关,h
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侵袭性真菌感染已成为公共卫生领域的重大威胁,白色念珠菌感染在临床上表现十分严峻,感染而引起的死亡率高。目前,临床上常用的唑类药物治疗白色念珠菌,白色念珠菌对药物耐药性的出现使得现有治疗方案的治疗效果不断降低。降低白色念珠的耐药性以及寻找新的治疗策略是控制白色念珠菌感染的关键。研究表明,白色念珠菌HDA1蛋白是一个重要的药物靶点,HDA1与白念珠菌的菌丝形态转变,白色—不透明型过渡等毒力特征有关,hda1基因的缺失可以降低白念珠菌对唑类药物的耐药性。本文通过结构生物学的方法研究抑制剂对HDA1蛋白的抑制机制,为进一步通过结构基础设计和筛选出高选择性抑制剂提供有力支持。抑制剂对人源HDAC蛋白有副作用,需要验证抑制剂对白色念珠菌HDA1蛋白的选择性。将抑制剂与数据库中同源性高的人源HDAC6,HDAC7,HDAC8进行结合实验,筛选出选择性抑制剂,为抑制剂结构的进一步设计提供方向。论文通过分子生物学的方法构建了p ET21a-sumo-hdac6 cd2,p ET21a-sumo-hdac7a and p ET21a-sumo-hdac8重组质粒,并通过原核系统对真核生物蛋白进行表达。利用成熟的蛋白提纯技术,对蛋白进行柱层析分离,最终得到高纯度的HDA1-N蛋白,H DAC8蛋白以及HDAC7A蛋白,HDAC6 CD2蛋白由于易形成多聚,暂时未能得到单体。对HDA1-N蛋白与11种抑制剂进行结合实验分析,热漂移实验结果表明A0,C3,R1,E2,A3抑制剂均表现出对HDA1-N有较强的结合能力,结合能力最好的是R1。A2抑制剂使得对HDA1-N蛋白结构破坏,热力学不稳定。热漂移数据与IC50数据吻合。同样,在HDAC8与11种抑制剂的结合实验中发现,A0,C3,C8,R1,A1,A2,E2表现出对HDAC8较强的结合能力。通过差值分析,A0,C3,R1对HDA1-N的结合能力较HDAC8高,选择性好。同时,A2,A3表现出对HDAC8的高选择性。A0,C3,R1对HDAC7A有结合,R1对HDA1-N较HDAC7A更具选择性。HDA1-N与抑制剂的共晶是通过浸泡法得到。在上海光源同步辐射中心得到了高分辨率数据并解析了HDA1-N Apo以及HDA1-N与五个抑制剂A0,C8,R1,D1,E2的复合结构。通过对HDA1-N与HDAC6 CD2,HDAC7A,HDAC8结构分析,HDA1-N的结合口袋开口面积较HDAC6 CD2,HDAC7A大,其口袋周围呈现疏水性。口袋外侧Loop1序列中HDA1-N多出4个氨基酸,这为设计选择性抑制剂提供了结构基础。通过对五个复合结构进行分析,抑制剂与HDA1-N的结合口袋中的His151,His152,Phe161,His193,Tyr222,Ser109有相互作用力,抑制了HDA1-N的去乙酰化能力,这为进一步设计突变验证抑制机制提供了重要参考。通过E2抑制剂与HDA1-N的Loop1结构的分析,E2可能与Loop1的Glu24形成类氢键相互作用,说明HDA1-N的Loop1与抑制剂的相互作用是提高选择性的关键。
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