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近年来,基因工程、蛋白质工程和酶工程技术的迅速发展,以及分离纯化与 检测手段的现代化,大大加快了发现新活性多肽的速度。研究与开发具有生物活 性或药物活性的肽类化合物,包括其前体肽片段的合成,已成为国际高新技术领 域竞争的一个重要部分。 RGD是近年来发现的具有较高应用价值的生物活性短肽,它是由精氨酸 (Arg)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)三个氨基酸组成的序列肽。RGD序列 肽能够竞争性抑制包括纤维蛋白Fib在内的各种粘附蛋白与血小板的结合,因而 抑制了Fib与血小板的结合,使之在未来的临床应用中具有良好的前景。 本文的目的是对RGD三肽的合成工艺和路线进行了探讨,研究了液相化学 法(DCC法、混合酸酐法等)合成GD二肽、RGD三肽的工艺,从而为RGD 三肽的规模化制备提供理论基础和必要的技术数据。同时首次开展了循环使用多 肽缩和剂的研究,以期降低多肽合成的成本。 本文以DCC法、混合酸酐法分别合成了RGD三肽前体二肽和全保护三肽, 最后脱去保护基得到RGD。研究了多种因素包括反应时间、溶剂种类、底物配 比等对化学合成RGD序列肽的影响。 本文对实验结果进行了理论分析,并做出了相对合理的解释,最终得到了如 下结论: (1)四氢呋喃(THF)和N,N.二甲基甲酰胺(DMF)为化学法合成RGD 前体二肽及全保护三肽的最佳溶剂。 (2)DCC法和混合酸酐法都得到了Boc.Gly.Asp.(oBzl)2中间体,为了进一 步合成三肽,必须先脱去Boc基,用无水HCl/EtoAc溶液和TFA两种方法,都 能很好地脱去Boc基,但用HCI/EtoAc溶液可以得到HCl-Gly-Asp-(oBzl)2晶体, 便于重结晶纯化,而用TFA得不到晶体,所以我们选择HCI/EtoAc溶液作为脱 Boc试剂。 (3)以四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂,DCC法合成全保护 三肽Boc— Arg(N02)一Gly— Asp-(oBzl)2,,得率76.1%。,为避免损失,直接由该三肽 油状物脱N端保护基,采用TFA为切割剂,室温切割3h,最大得率70.1%(以 Boc— Arg(N02)一OH汁算):以四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)为最优溶剂, <WP=5>混合酸酐法合成全保护三肽Boc— Arg(N02)一Gly-Asp-(oBzl)2,得率52.2%。为避免 损失,直接由该三肽油状物脱N端保护基,采用TFA为切割剂,室温切割3h, 最大得率83.8%,(以Boc— Arg(N02)-OH计算),但干燥效果没有DCC法好。 (4)以脱除N端保护的三肽为前体,采用Pd/C催化加氢脱除所有侧链保 护基团,得到RGD粗品,得率97.4%。 (5)首次对常用的多肽缩合剂DCC/HOBt进行回收循环使用的研究,对后 处理液加以酸化处理,回收得到HOBt,回收率75.4%;对反应中生成的DCU加 以脱水处理,采用三氯氧磷作为脱水剂,得到DCC,得率64%。 (6)对RGD的合成进行了成本核算,按照生产lkgRGD,计算,通过回收 缩合剂及合成部分保护氨基酸, 大大降低了RGD的生产成本,从35559.65元 /kg降为14467.61元/kg, 仅仅缩合剂回收就降低了总成本的11%。