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外植体褐变是组织培养过程中的三大难题之一，普遍认为是酚类物质的酶促氧化过程，前期研究证实蝴蝶兰叶片外植体褐变的关键酶主要是POD、PPO和PAL，三者的应答关系尚未清楚，ROS在褐变过程中的作用亦未探讨。本研究通过了解蝴蝶兰叶片外植体褐变发生初期(离体培养初期，0-3d)与细胞内源ROS水平(O2-、H2O2和丙二醛含量)变化的关系，分析褐变相关基因(POD、PPO、PAL)在蝴蝶兰叶片外植体褐变发生初期的表达变化，为认识褐变发生分子机理奠定基础，促进组培褐化问题的解决。主要结果如下： 1.蝴蝶兰叶片外植体离体培养初期，褐变主要发生在创口面，至第3d褐变率接近100％；POD酶活先升后降，POD表达量有两次增加；PPO酶活及基因的变化分为三个时期：快速响应期，倦怠期和再次响应期；PAL表达量持续增加；外植体发生脂质过氧化。 2.蝴蝶兰叶片外植体经柠檬酸处理，褐变程度减轻；POD酶活性降低，POD前两个响应时间缩短；PPO酶活性被抑制，PPO表达量增加；PAL表达模式改变，与PPO相似；外植体脂质过氧化水平降低。外植体经儿茶酚处理，褐变程度加重明显；POD酶活及基因表达量降低；PPO酶活性提高，PPO表达量降低；PAL表达情况与柠檬酸处理组相同；外植体O2-·含量(NBT染色)减少，脂质过氧化水平低于柠檬酸处理组。外植体经叠氮钠处理，褐变程度减轻明显；POD酶活增加，POD表达量降低；PPO酶活增加，PPO表达倦怠期延长；PAL表达快速响应期延长；外植体过氧化水平最低。 3.蝴蝶兰叶片外植体经百草枯处理，白化脱绿，核酸被破坏；POD酶活高峰提前出现；PPO酶活大小在0d-2d与对照相同，2.5d-3d酶活升高；外植体过氧化水平与柠檬酸处理组无明显差异。 综上说述，蝴蝶兰叶片外植体离体培养初期，外植体受切割伤害后，PPO和PAL快速响应，激活酶前体并启动基因转录，PAL催化产生多酚类物质，PPO催化氧化多酚类物质；POD在胞内ROS积累后发挥清除作用，ROS增加影响PPO酶活性。 另外，本文附文初探了蝴蝶兰叶片外植体褐变细胞死亡方式，结果发现外植体随着离体培养时间的延长，褐变加剧，细胞从创口面到组织内部受褐色物质侵入，叶绿体解体，细胞核空泡化继而破裂，基因组DNA弥散状降解，细胞发生质壁分离。推测蝴蝶兰叶片外植体褐变细胞呈坏死死亡。