目的：　　本课题前期通过靶向捕获二代测序技术对1142例中重型β-地中海贫血患者的β-珠蛋白基因簇进行测序，鉴定了271个常见SNP，并对这些SNP的潜在地贫表型改善作用进行评估，发现Aγ-珠蛋白基因上有一个突变率相当高的变异Aγ+25(G＞A，rs368698783)处于LγAR结合序列G(G)TTAT上并与Gγ-158(C＞T，XmnⅠ多态性)几乎完全连锁。笔者猜想Aγ+25变异会使LYAR结合程度减弱而使其抑制γ+珠蛋白基因作用减弱而在红系压力下开放γ-珠蛋白基因表达。本课题将针对中国南方正常人群、β-地中海贫血基因携带者、β-地中海贫血纯合子或双重杂合子患者及泰国东南部HbE纯合突变患者共2738例进行系统性的基因型-表型分析，并从mRNA表达方面对Aγ+25变异的影响进行精细定位。　　方法：　　1、队列设计及表型分析　　(1)队列设计　　本课题连续随机收集样本2738例，按照HBB基因型分为4个队列。1）队列A:中国南方人群，513例非地中海贫血样本(αα/αα，βN/βN);2)队列B:中国南方人群，512例β-地中海贫血携带者(αα/αα，βM/βN);3）队列C:中国南方人群，1142例中重型β-地中海贫血患者(未排除α-地贫，βM/βM);4）队列D:泰国东南地区人群，568例HbE纯合突变样本(未排除α-地贫，βE/βE)。　　(2)表型分析　　主要检测指标如下:血红蛋白含量，红细胞比容，平均红细胞体积，平均红细胞血红蛋白量，平均红细胞血红蛋白浓度，红细胞分布宽度，Hb F，Hb A2。并按照血红蛋白量、发病年龄、4岁前输血频率以及并发症对β-地中海贫血患者进行临床分类:重型β-地中海贫血或中间型β-地中海贫血。　　2、分子遗传检测　　(1)HBA及HBB基因型检测　　多重Gap-PCR检测中国人群3种常见缺失型α-地中海贫血;PCR结合RDB技术检测点突变型α-地中海贫血及β-地中海贫血。　　(2)靶向捕获二代测序对β-珠蛋白基因簇的SNP分型　　使用Agilent SureDesign平台对β-珠蛋白基因簇80kb的序列进行高密度探针设计并定制芯片，使用HiSeq2000进行定制化芯片测序及生物信息学分析。　　(3)HBG启动子遗传变异检测　　限制性内切酶法鉴别Gγ-158(rs7482144，XmnⅠ)基因型;Sanger测序法鉴别Aγ+25(rs368698783)基因型。　　(4)Gγ/AγmRNA表达分析　　笔者使用Bioedit软件对cDNA扩增的γ-珠蛋白转录本sanger测序峰图进行分析，得到Gγ/Aγ mRNA表达的比值，以Gγ/Aγ表达量比值来反映Gγ-158突变与Aγ+25突变连锁及不连锁时带来的功能影响。　　3、统计分析　　使用Haploview软件对SNP进行连锁平衡分析;使用其Tagger模块进行标签SNP的选择及其连锁SNP的捕获。使用PLINK软件SNP进行Hb F关联分析及conditional分析以评估SNP对HbF的调控作用。使用逐步回归的Cox比例风险模型以中重型β-地中海贫血患者的无输血生存时间为评价标准对潜在β-地中海贫血调节因素进行多因素分析。使用Mann-Whitney U检验（两组间）或Kruskal-Wallis检验（多组间）对队列A-D不同基因型的血液学指标及临床表现进行比较。使用卡方检验对样本性别等构成比资料进行比较。生存曲线使用Kaplan-Meier方法进行绘制，其统计学差异使用对数秩和检验进行。　　结果：　　1、对β-珠蛋白基因簇中表型调控SNP的系统扫描鉴定Aγ+25变异　　笔者使用目标序列靶向捕获二代测序对队列C中1142例中重型β-地中海贫血患者的β-珠蛋白基因簇进行测序，鉴定了β-珠蛋白基因簇上MAF＞0.01的271个常见SNP，以SNP之间连锁程度r2＞0.8为标准将271个SNP捕获分布于162个LD区间中。笔者对单个SNP进行Hb F关联分析(Association study)作为初步筛选，得到153个显著关联SNP(P＜0.05)分布于53个LD中;以P值最显著的SNP作为每个LD的标签SNP(tag-SNP)，纳入逐步回归的Cox比例风险模型，并同时纳入10个已知β-地贫疾病风险因子，模型得到7个LD包括66个SNP对患者无输血生存时间具有显著贡献度;笔者在7个LD中共鉴定出了3个潜在功能性rSNP位于红系转录因子结合序列内(rs10768737-NFIC，rs368698783-LYAR及rs5010981-KLF10)。笔者注意到rs368698783(G＞A，Aγ+25)，位于γ-珠蛋白基因抑制因子LYAR的保守结合序列(G(G)TTAT)内，在上述分析中都显示了其对β-地中海贫血表型及Hb F水平的强修饰效应，在与其几乎完全连锁的Gγ-158变异的比较中也显示出更强的修饰效应(HR=0.570，P=2.178×10-12)，并通过conditional分析鉴定了Aγ+25变异能独立于其他2个潜在功能性rSNP调控Hb F水平，为其对β-地中海贫血表型的独立修饰作用提供了依据。　　2、Aγ+25变异在中国南方及泰国HbEE人群中具有广泛突变谱　　笔者在2170例连续随机中国南方人群样本（队列A、B、C）中鉴定了388个突变的A等位基因(DAF=0.089)，其中杂合突变338例，纯合突变25例。在568例泰国东南部地区HbEE患者（队列D）中，鉴定896个突变的A等位基因(DAF=0.789)，其中杂合突变180例，纯合突变358例;鉴定Aγ+25变异与HbE突变(HBB:c.79G＞A)具有连锁不平衡关系(D=0.715，R2=0.210)。　　3、Aγ+25变异可调控HbF的表达以减轻β-地中海贫血表型严重性　　笔者对2738例人群样本的HbF表达水平进行了检测，结果显示携带Aγ+25突变等位基因的个体Hb F均有不同程度的Hb F升高，在红系压力存在的情况下，Aγ+25变异带来的Hb F表达量上升更为显著。笔者将队列C与队列D中的中重型β-地中海贫血与HbEE患者统一遗传背景后针对其血液学及临床表型进行单因素分析，排除了其他强修饰效应对β-地中海贫血表型的改善作用，这种情况下，队列C中499例Aγ+25野生型与81例突变等位基因携带样本相比，Aγ+25突变使HbF上升了1倍，发病年龄推迟了6个月，不依赖于系统性输血的病人增加了约17％，临床表型为中间型的地中海贫血患者比例增加了1半。队列D中，24例Aγ+25野生型与362例突变等位基因携带样本相比，在Hb F本底值较高的情况下，Aγ+25突变仍使HbF上升了约1倍。　　4、Aγ+25变异可影响Gγ/Aγ的相对表达量　　笔者对队列A、B、C中59例随机样本进行了mRNA分析，对25例随机样本进行了肽链分析，鉴定了Aγ+25的突变等位基因能导致Gγ/Aγ再转录与翻译水平的表达比值上升，且每种基因型间均产生显著差异，鉴定了2例Gγ-158杂合突变Aγ+25野生型样本Gγ/Aγ表达比值不改变，并鉴定了Aγ+25变异在红系压力下可造成Aγ-珠蛋白基因偏向于突变等位基因表达。　　结论：　　1、笔者通过β-珠蛋白基因簇的271个常见SNP对β-地中海贫血表型修饰作用的评估，鉴定了位于Aγ-珠蛋白基因(HBG1)5UTR上的+25位变异(rs368698783)作为β-地中海贫血表型遗传性修饰基因，可代表与其高度连锁的单核苷酸变异区间独立或主要作用于调节HbF表达水平与改善β-地中海贫血严重性，且在红系压力的作用下更为有效。　　2、笔者在两大人群中验证了Aγ+25变异对β-地中海贫血表型的改善作用，Aγ+25突变在中国南方人群中具有广泛的突变谱，其纯合突变能极大概率地提升重型β-地中海贫血患者的生存质量;泰国HbEE患者与Aγ+25突变存在着连锁不平衡效应，约80％患者携带Aγ+25变异，对减轻患者表型起了极大的作用。　　3、笔者鉴定了Aγ+25变异对Gγ/Aγ相对表达量的影响，并伴有等位基因表达偏移的现象，为Aγ+25变异带来的潜在功能性改变提供了一定的依据。