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第一部分选择性激活基底前脑胆碱能神经元对脓毒症炎症反应的影响目的:基底前脑(basal forebrain,BF)内的胆碱能神经元在动物不同行为状态下的脑皮层活动调节中发挥重要的作用,如睡眠觉醒的调节、皮层活跃度的改变、学习与记忆等,但BF内的胆碱能神经元在调节炎症反应中的作用并不清楚。因此,我们采用光遗传学方法选择性激活BF胆碱能神经元,观察对脓毒症炎症反应的影响。方法:使用脑立体定位仪分别将光纤套管埋置于WT小鼠和ChAT-ChR2-EYFP小鼠的基底前脑,术后恢复一周进行后续实验。采用盲肠结扎穿孔脓毒症模型(cecal ligation and puncture,CLP),将埋置好光纤的WT小鼠和ChAT-ChR2-EYFP小鼠随机分为光刺激组和未光刺激组(光刺激参数:20 Hz/30 ms,刺激时间为15 s),使用473 nm的蓝光激活WT小鼠和ChAT-ChR2-EYFP小鼠BF的胆碱能神经元,随后收集假手术组、WT光刺激组、WT未光刺激组、ChAT-ChR2-EYFP光刺激组、ChAT-ChR2-EYFP未光刺激组小鼠CLP术后3h和12h的血清、脾脏组织上清样本,采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测促炎因子TNF-α、IL-6和抗炎因子IL-10的表达。结果:WT光刺激组、WT未光刺激组、ChAT-ChR2-EYFP未光刺激组小鼠CLP术后3h和12h炎症因子表达无统计学差异;与ChAT-ChR2-EYFP未光刺激组小鼠相比,ChAT-ChR2-EYFP光刺激组小鼠CLP术后3h和12h促炎因子TNF-α、IL-6的表达水平均显著下降,而抗炎因子IL-10的表达水平无明显差异。结论:光刺激基底前脑胆碱能神经元能够减轻脓毒症小鼠的全身炎症反应。第二部分迷走神经参与基底前脑胆碱能神经元对脓毒症炎症反应的调控目的:迷走神经除调节心率、支气管收缩和胃肠蠕动等生理功能外,还可以调节TNF-α、IL-1β等促炎因子的释放。抗炎信号经迷走神经传出纤维到达心脏、肝脏、肾脏和脾脏等器官,随后释放的乙酰胆碱神经递质与巨噬细胞及其他分泌细胞因子细胞表面的α7型烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,a7 nAchR)结合,抑制细胞促炎因子的合成。但迷走神经是否介导激活BF胆碱能神经元减轻脓毒症炎症反应这一过程仍需要阐明,因此我们通过切断单侧迷走神经的方法观察迷走神经在BF胆碱能神经元对脓毒症炎症反应调控中的作用。方法:对埋置好光纤的WT小鼠和ChAT-ChR2-EYFP小鼠实施左侧颈部迷走神经切除术(left cervical vagotomy,LcVGX),3天后建立CLP脓毒症小鼠模型,将小鼠随机分为假手术组、WT光刺激组、WT光刺激+LcVGX组、ChAT-ChR2-EYFP光刺激组、ChAT-ChR2-EYFP光刺激+LcVGX组,使用473 nm的蓝光激活(光刺激参数:20 Hz/30 ms,刺激时间为15 s)小鼠BF的胆碱能神经元,随后收集小鼠CLP术后3h和12h的血清、脾脏组织上清样本,采用酶联免疫吸附法检测促炎因子TNF-α、IL-6的表达。结果:WT光刺激组、WT光刺激+LcVGX组小鼠CLP术后3h和12h炎症因子表达无统计学差异,说明左侧颈部迷走神经切除对外周炎症反应的调节几乎无影响;前期结果表明,光刺激激活ChAT-ChR2-EYFP小鼠BF的胆碱能神经元能够降低促炎因子TNF-α、IL-6的表达,而实施LcVGX的ChAT-ChR2-EYFP光刺激小鼠炎症因子下降的现象被逆转。结论:迷走神经参与并介导了基底前脑胆碱能神经元对脓毒症小鼠炎症反应的调控,在脓毒症神经免疫调节过程中发挥不可或缺的作用。第三部分选择性激活基底前脑胆碱能神经元调节脓毒症炎症反应的中枢机制目的:激活BF胆碱能神经元通过迷走神经减轻脓毒症的全身炎症反应,但BF胆碱能神经元调节炎症反应的中枢机制并不明确。方法:将埋置好光纤的ChAT-ChR2-EYFP小鼠随机分为两组,ChAT-ChR2-EYFP光刺激组和ChAT-ChR2-EYFP未光刺激组,使用473 nm的蓝光激活(光刺激参数:20 Hz/30 ms,刺激时间为15 s)小鼠BF的胆碱能神经元,刺激3h后进行心脏灌注取脑,将脑组织进行甲醛后固定和蔗糖梯度脱水,最终采用冰冻切片免疫荧光染色的方法观察核团c-Fos的表达变化。结果:光刺激ChAT-ChR2-EYFP小鼠BF胆碱能神经元后,观察到BF区域出现许多c-Fos 阳性ChAT 阳性双标的神经元。不仅如此,迷走神经背核/孤束核腹侧部(dorsal motor nucleus of the vagus/ventral part of the solitary nucleus,DMN/SolV)c-Fos阳性神经元的数目也增多,但c-Fos 阳性神经元并不是胆碱能神经元。而未进行光刺激的ChAT-ChR2-EYFP小鼠,在BF和DMN/SolV区域几乎没有c-Fos的表达。结论:选择性激活小鼠BF的胆碱能神经元可以兴奋DMN/SolV的神经元,且DMN/SolV处兴奋的神经元是非胆碱能的其他类型神经元。第四部分DMN/SolV的多巴胺能神经元介导基底前脑胆碱能神经元对脓毒症外周炎症反应的调节目的:区分DMN/SolV区域c-Fos阳性神经元的类型,探索DMN/SolV此类神经元参与调节脓毒症炎症反应的作用机制。方法:采用免疫荧光双标染色的方法对DMN/SolV区域c-Fos 阳性神经元的类型进行筛选。脾内注射交感神经毁损药物6-羟基多巴胺(6-Hydroxydopamine,6-OHDA)阻断脾脏多巴胺能神经元的传入,药物注射后12h收集小鼠血清、脾脏组织上清样本,采用ELISA的方法检测促炎因子TNF-α、IL-6和抗炎因子IL-10的表达。结果:DMN/SolV区域c-Fos 阳性TH阳性神经元占35.2%,而c-Fos 阳性ChAT阳性神经元仅占6.1%,说明DMN/SolV c-Fos 阳性神经元主要是多巴胺能神经元。此前结果已表明,光刺激ChAT-ChR2-EYFP小鼠BF胆碱能神经元导致促炎因子TNF-α、IL-6的表达下降,给予光刺激ChAT-ChR2-EYFP小鼠脾内注射6-OHDA后,这种炎症因子下降的现象被逆转。结论:DMN/SolV的多巴胺能神经元参与了 BF胆碱能神经元对脓毒症外周炎症反应的调节,BF-DMN/SolV-迷走神经可能是脓毒症抗炎效应产生的具体机制。