论文部分内容阅读
目的：本研究采用siRNA技术,构建pSUPER-siCD46重组质粒,与本室保存的pSUPER-siCD59重组质粒,观测CD46和CD59特异性沉默对T细胞信号转导的影响,旨在探讨CD59与CD46在T细胞信号转导中的协同效应。方法：构建pSUPER-siCD46重组质粒,利用PCR、质粒双酶切及DNA测序对其进行鉴定。应用阳离子脂质体法转染Jurkat细胞,将细胞分为未转染的Jurkat细胞(Ⅰ组)、转染pSUPER空质粒Jurkat细胞(Ⅱ组)、转染pSUPER-siCD59重组质粒Jurkat细胞(Ⅲ组)和转染pSUPER-siCD46重组质粒Jurkat细胞(Ⅳ组),G418筛选稳定表达的细胞克隆。采用RT-PCR、 Westernblot检测各组细胞中CD46和CD59基因的表达。应用CD59、CD46的单克隆抗体联合作用于各组Jurkat细胞,MTT法测细胞增殖、Western Blot测ZAP-70磷酸化的水平。结果：经PCR、限制性内切酶双酶切及测序鉴定,结果表明重组质粒序列插入正确。重组质粒pSUPER-siCD59和pSUPER-siCD46分别转染的Jurkat细胞,可表达绿色荧光蛋白,经G418筛选,得到阳性细胞克隆；RT-PCR结果显示：Ⅲ组CD59mRNA和Ⅳ组CD46mRNA的表达均被明显抑制,与Ⅰ、Ⅱ组相比较(P<0.05),差异有显著性。CD59mAb、CD46mAb联合作用于T细胞,Ⅰ组细胞的增殖能力,ZAP-70磷酸化条带的灰度值明显高于Ⅲ、Ⅳ组,差异有显著性(P<0.05),,其中Ⅱ组低于Ⅲ组(P<0.05),差异有显著性,但Ⅰ、Ⅱ组之间比较(P>0.05),差异无统计学意义。结论：成功构建了重组质粒PSUPER-siCD46;分别建立了稳定转染重组质粒pSUPER-siCD59、 pSUPER-siCD46的Jurkat细胞真核表达系统；RT-PCR实验从mRNA水平证明重组质粒PSUPER-siCD59和pSUPER-siCD46可分别特异性地沉默CD59基因和CD46基因；通过MTT、 Western Blot实验证实,在CD59与CD46的共同作用下,Jurkat细胞的增殖、ZAP-70的磷酸化显著增强,由此证明CD59、CD46在T细胞信号转导过程中存在协同作用。该研究创新之处在于,为跨膜蛋白CD46在GPI锚固蛋白CD59的T细胞跨膜信号转导中的作用提供了实验依据,为T细胞白血病的基因靶向治疗开辟了一条新的途径,具有重要的理论意义及广阔的临床应用前景。