乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,全世界每年约120万妇女发病,50万妇女死于乳腺癌。尽管目前在乳腺癌的综合治疗方面已取得了长足进步,但仍有20%～30%的乳腺癌患者治疗后局部复发和远处转移。因此探索新的治疗手段成为进一步提高乳腺癌治疗效果的突破口。放射治疗是恶性肿瘤治疗的主要手段之一,而肿瘤细胞的放射敏感性是决定放射治疗疗效的关键因素。近年来,随着对肿瘤放射生物学的深入研究,发现一些基因表达影响着肿瘤细胞的放射敏感性。基因治疗策略可将肿瘤细胞中特异或差异表达的基因敲除,实现特定基因在体内的可控性表达,逆转肿瘤细胞对放化疗的抗拒,从而增加其治疗的敏感性。Peroxiredoxins(Prxs)是新发现的一类过氧化物酶,在清除体内活性氧中发挥着重要作用,可保护细胞免受过氧化反应造成的损伤。PeroxiredoxinⅠ(PrxⅠ)是Prxs蛋白家族成员之一,在包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤细胞中存在过表达,其表达与肿瘤细胞的增殖、分化、转移、复发及放化疗敏感性密切相关,并可作为诊断肿瘤的分子标志。因此,PrxⅠ可能是肿瘤基因治疗的理想靶点。DNA双链断裂(Double strand break,DSB)是电离辐射治疗肿瘤的重要机制。DNA损伤后可激活机体内的损伤修复系统,使受损的DNA得以及时修复,以保证机体基因组的稳定。研究发现:DNA损伤感应分子γ-H2AX和DNA损伤修复的关键蛋白Rad51可能在其发挥重要作用。本研究将基因治疗和放射治疗结合起来,以PrxⅠ为靶点,构建针对PrxⅠ特异性的shRNA真核表达载体,下调乳腺癌MCF-7细胞中PrxⅠ的表达,观察其对放射线的敏感性变化,并探讨相关作用机制,阐明PrxⅠ基因在乳腺癌放射治疗中的作用,为乳腺癌基因治疗提供新的靶位。方法与结果第一部分:靶向PeroxiredoxinⅠ基因的shRNA真核表达载体构建及功能鉴定方法:根据RNA干扰设计原则,设计并合成四条靶向PrxⅠ基因的shRNA干扰序列及阴性对照序列(HK)。先用BbsⅠ及BamHⅠ限制性内切酶双酶切pGPU6/GFP/Neo质粒载体使之线性化,然后通过DNA连接酶将shRNA连接至质粒载体中,经转化、筛选、阳性克隆扩增、抽提重组质粒DNA后,行BamHⅠ、PstⅠ单酶切和DNA测序鉴定;将鉴定正确重组质粒通过脂质体转染入乳腺癌MCF-7细胞。荧光显微镜、流式细胞仪观察并检测转染48h时转染效率;采用RT-PCR及Western blot检测转染前后细胞中的PrxⅠmRNA和蛋白表达变化。结果:成功构建了四个靶向PrxⅠ基因的shRNA真核表达载体pGPU6-Prx1、pGPU6-Prx2、pGPU6-Prx3、pGPU6-Prx4及阴性表达载体pGPU6-HK,通过脂质体将上述五个重组质粒成功转染入乳腺癌MCF-7细胞中,48h后检测发现各组细胞转染效率均在80%左右。RT-PCR及Western blot检测发现:四个重组质粒均能明显下调乳腺癌细胞MCF-7中的PrxⅠ基因表达,其中pGPU6-Prx3重组质粒的抑制效果最明显,其mRNA及蛋白表达分别抑制了82.6%和80.5%,与对照组和pGPU6-HK组比较差异具有显著性(P<0.05)。成功筛选出抑制效果最佳的一条shRNA,为后续PrxⅠ基因的功能研究奠定了基础。第二部分:靶向沉默PeroxiredoxinⅠ基因对乳腺癌细胞放射敏感性的影响及其作用机制方法:将pGPU6-HK、pGPU6-Prx3重组质粒通过脂质体转染入乳腺癌细胞中,通过G418加压筛选建立稳定细胞株,采用RT-PCR、Western blot检测PrxⅠ基因的mRNA和蛋白表达水平。实验分四组:pGPU6-HK组、pGPU6-PrxⅠ组、pGPU6-HK+照射(IR)组、pGPU6-PrxⅠ+IR组。IR组给予单次剂量6Gy的X线照射,在照射48h时通过流式细胞仪检测细胞内活性氧水平、细胞周期、细胞凋亡的变化;MTT法检测细胞增殖能力;Hoechst法观察细胞核形态变化,间接判定细胞凋亡情况;克隆形成实验检测经0、2、4、6、8、10Gy剂量照射后细胞克隆形成率,绘制细胞存活曲线,计算放射生物学参数Do、N、Dq、SF2值,判断细胞的放射敏感性变化;采用Western blot检测DNA双链断裂的标志性蛋白γ-H2AX以及DNA损伤后修复的关键蛋白Rad51表达。结果:通过G418加压筛选4周后获取了2个稳定细胞株:pGPU6-PrxⅠ和pGPU6-HK。RT-PCR和Western bolt检测发现:与pGPU6-HK组相比,pGPU6-PrxⅠ组中PrxⅠmRNA和蛋白表达量明显减少,抑制率分别为84.8%和83.5%,差异具有显著性(P﹤0.05)。MTT、流式细胞及Hoechst检测结果显示:给予6Gy的X射线照射48h后,pGPU6-PrxⅠ组及联合IR组中细胞内活性氧水平明显升高、G1期增多、S期细胞减少、细胞凋亡显著增加、细胞增殖明显延迟、核浓缩、碎片化等凋亡典型形态改变的细胞增多,与pGPU6-HK比较,差异均具有显著性(P﹤0.05);其中以pGPU6-PrxⅠ+IR组上述变化最明显,与pGPU6-PrxⅠ及pGPU6-HK+IR比较,差异也具有显著性(P﹤0.05)。克隆形成实验结果显示:经不同放射剂量的X线照射后,pGPU6-PrxⅠ组及联合IR组中细胞克隆形成率降低,其中pGPU6-PrxⅠ+IR组细胞的放射生物学参数Do、N、Dq、SF2值分别为1.354、3.106、1.547、0.504,2Gy照射剂量时SER为1.353;Western blot检测结果显示:pGPU6-PrxⅠ组及联合IR组中Rad51蛋白表达明显降低,而γ-H2AX蛋白表达显著升高,与pGPU6-HK组相比,差异具有显著性(P﹤0.01),以pGPU6-PrxⅠ+IR组中更明显,其Rad51蛋白表达下降了79.3%,而γ-H2AX蛋白表达升高了3.7倍,与pGPU6-PrxⅠ组、pGPU6-HK+IR组相比,差异也具有显著性(P﹤0.05)。第三部分:靶向沉默PeroxiredoxinⅠ基因对乳腺癌裸鼠移植瘤放射敏感性的影响方法:将稳定筛选的pGPU6-HK、pGPU6-PrxⅠ两株细胞接种于BALB/c裸鼠皮下,以肿瘤长径达5mm作为判断乳腺癌移植瘤模型建立成功标准。实验分四组:pGPU6-HK组、pGPU6-PrxⅠ组、pGPU6-HK+照射(IR)组、pGPU6-PrxⅠ+IR组。IR组给予每次2Gy,隔日一次,总剂量为10Gy,观察移植瘤生长变化,照射第30d处死裸鼠,剥离肿瘤组织,称取瘤重,计算抑瘤率;免疫组化检测肿瘤组织中的PrxⅠ和促凋亡蛋白Caspase3表达;透射电镜观察肿瘤组织细胞的超微结构;Western blot检测肿瘤组织中DNA双链断裂的标志性蛋白γ-H2AX以及DNA损伤后修复的关键蛋白Rad51表达。结果:成功建立了裸鼠移植瘤模型,pGPU6-HK组及pGPU6-PrxⅠ组细胞成瘤时间分别为10d和14d,pGPU6-PrxⅠ组移植瘤生长相对较慢,肿瘤体积较小,重量较轻,其抑瘤率为37.8%,与pGPU6-HK组相比,差异具有显著性(P﹤0.01)。当给予10Gy的X线剂量照射后,联合IR组裸鼠移植瘤消退速度大于生长速度,肿瘤体积缩小,但在照射结束后第三天肿瘤出现正生长,其生长速度较pGPU6-HK、pGPU6-PrxⅠ组明显缓慢,以pGPU6-PrxⅠ+IR组更为明显,其抑瘤率达到了79.76%,与pGPU6-PrxⅠ(34.92%)、pGPU6-HK+IR(56.94%)比较差异具有显著性(P<0.05)。免疫组化结果及电镜结果显示:pGPU6-PrxⅠ及联合IR组肿瘤细胞中PrxⅠ蛋白表达明显下调,而促凋亡蛋白Caspase3表达显著提高,凋亡、坏死细胞增多。Western bolt结果显示:pGPU6-PrxⅠ及联合IR组肿瘤细胞中的Rad51蛋白表达降低,而γ-H2AX蛋白表达升高,与pGPU6-HK组相比,差异具有显著性(P<0.01)。上述变化pGPU6-PrxⅠ+IR组最为明显,其Rad51蛋白表达抑制了84.8%,γ-H2AX蛋白表达升高5.6倍,与pGPU6-PrxⅠ和pGPU6-HK+IR组相比,差异也具有显著性(P<0.05)。结论:本研究成功构建了靶向PrxⅠ基因shRNA真核表达载体,从体外、体内证实了靶向沉默PrxⅠ基因后,可有效抑制细胞增殖、调控细胞周期再分布、促进细胞凋亡、降低细胞亚致死损伤修复能力,提高放射治疗增益比,从而增加了乳腺癌MCF-7细胞的放射敏感性,其作用机制可能与细胞内活性氧清除能力减弱、DNA双链断裂增加及DNA损伤后修复能力降低有关。PrxⅠ基因表达与乳腺癌细胞的放射敏感性呈负相关,可作为乳腺癌放射增敏的分子靶点。