论文部分内容阅读
目的:进一步探讨脑胶质瘤化疗是否存在旁观者效应及该效应与缝隙连接细胞间通讯功能的关系。方法:①质粒的转化、扩增、提取及纯化、酶切鉴定:通过氯化钙法将质粒转入JM109 菌株,在含氨苄青毒素的LB 培养基中筛选阳性菌落扩增,然后用Wizard PureFection 质粒DNA 纯化系统试剂盒进行提取及纯化,最后用EcorI、HindIII 内切酶进行酶切鉴定;②基因转染:首先以含不同浓度G418的培养基培养C6 鼠胶质瘤细胞,得到使C6 细胞全部死亡的最低药物浓度,确定为筛选浓度,然后通过LipofectAMINE2000介导对C6细胞进行质粒DNA转染,用G418 筛选浓度筛选出转染成功细胞,用半定量RT-PCR 检测转染后C6 细胞Cx43mRNA 的表达量的改变,划痕荷载染料传输实验(SLDT)检测转染前后缝隙连接细胞间通讯功能,MTT 法检测转染Cx43 基因对C6 细胞增殖率的影响。③混合培养观察化疗旁观者效应:将转染后细胞分成VM-26 处理组与VM-26 未处理组细胞,然后将两组细胞按一定比例进行混合培养,以MTT 法检测各组细胞存活率,用流式细胞仪技术检测各组细胞凋亡率,观察缝隙连接细胞间通讯功能上调前、后脑胶质瘤化疗的旁观者效应。④用缝隙连接阻断剂18-α甘草次酸(AGA)干预实验,观察旁观者效应与缝隙连接的关系:在培养基中加入AGA,用SLDT 检测AGA 对Cx43 基因转染后C6 细胞GJIC 功能的影响;并重复混合培养步骤,观察AGA 对旁观者效应的影响。结果:①获得可供转染的高纯度质粒;②获得转染了相应质粒的细胞株C6-Cx43 及C6-Non;③C6-Cx43 细胞Cx43mRNA 表达显著增加,染料传输能力较C6-Non 明显增强;④C6 脑胶质细胞缝隙连接细胞间通讯功能低下,肿瘤化疗不表现出旁观者效应或该效应非常弱,但当转染Cx43cDNA,明显上调C6 细胞缝隙连接细胞间通讯功能后,化疗药物的细胞毒性作用得到明显放大;⑤使用AGA 后,C6-Cx43 细胞染料传输能力受到明显抑制,化疗旁观者效应也明显受到抑制。