随着全球工业化进程的快速发展,能源和环境危机已成为全人类共同面对的难题。在工业生产过程中,这一问题尤为突出,寻找合理的解决之路已然迫在眉睫。而由生物催化主导的生产过程为此打开了一扇新的大门,生物催化法利用酶作为催化剂表现出良好的选择性、专一性、高效性和绿色性,使用生物催化法代替传统的化学催化法突显出更大的应用前景。但由于游离酶自身的一些缺陷限制了酶的工业化应用,而固定化酶可以很好地解决这些弊端。传统的酶固定化方法存在诸多缺点,为适应生物催化的规模化推广及更好的满足工业需求,迫切需要开发新型的酶固定化技术。核酸适配体是一类能够对靶分子产生特异性相互作用的核酸单链,被广泛应用于分子捕获、生物成像、生物检测、临床诊断、药物载送等领域。核酸适配体的高亲和力和特异性使其在酶的固定化方面具有广阔的开发潜力。本论文以开发新型酶固定化技术为目的,以甘草酸的生物催化转化为应用平台,通过改进的SELEX技术筛选β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E)的核酸适配体,并将其共价连接在氧化石墨烯和磁珠上,用于PGUS-E的一步纯化固定化,进而生产高附加值甘草酸衍生物。主要研究内容及结果如下:(1)β-葡萄糖醛酸苷酶核酸适配体的筛选及表征通过镍离子亲和层析、离子交换、分子筛等方法对β-葡萄糖醛酸苷酶进行纯化,并将其负载到Ni-NTA磁珠上作为靶分子进行SELEX筛选。以包含40 nt随机序列的ssDNA作为初始文库,通过孵育、分离、扩增、制备ssDNA完成一个筛选循环。同时为提高筛选特异性,每三轮进行一次反向筛选过程。调整磁珠用量、孵育时间、洗涤次数等参数提高筛选效率。鉴于催化反应温度的要求,将孵育温度提高到40℃又进行了6轮筛选。筛选结束后经过克隆、测序总共得到16条ssDNA序列。用表面等离子体共振技术测定其与PGUS-E的亲和力,结果表明筛选得到的aptamer的解离常数在纳摩尔级别,并且对PGUS-E酶活没有抑制作用。(2)Aptamer与载体的共价连接及表征选用比表面积极大、水溶性极好的氧化石墨烯作为载体材料,通过化学改性提高其羧基官能团富含量。将氨基修饰的aptamer通过酰胺反应共价连接到氧化石墨烯上,并用UV-可见吸收光谱、荧光显微镜、FTIR等对其进行表征;用同样的方法将aptamer共价连接的羧基功能化的二氧化硅磁珠上,并进行相关表征。结果发现,改性的氧化石墨烯对Apt5和Apt9的负载量分别为29.08μg/mg和35.03μg/mg;羧基磁珠对Apt5和Apt9的负载量分别为10.685μg/mg和13.565μg/mg。(3)Aptamer与PGUS-E之间的相互作用考察了离子强度和pH值对aptamer与PGUS-E之间相互作用的影响。以NaCl浓度控制离子强度大小,发现当NaCl浓度大于0.3 M时可以破坏aptamer与PGUS-E之间的相互作用;NaCl浓度为1 M时可以实现aptamer连接的磁珠的再生。pH变化对二者相互作用的影响很小,敏感程度远不及离子强度。pH为4和7时对二者相互作用有轻微影响。对aptamer与PGUS-E的吸附行为进行拟合,发现可以用Tenkin等温吸附模型、准二级动力学模型、Elovich动力学模型和Webber-Morris内扩散动力学模型对这一过程进行描述和预测。(4)β-葡萄糖醛酸苷酶核酸适配体的应用将筛选得到的aptamer用于β-葡萄糖醛酸苷酶的一步纯化固定化,并将固定化酶用于甘草酸的催化转化过程,结果发现aptamer连接的磁珠对PGUS-E的最大负载量约为32μg/mg,经过7个反应批次后Apt5和Apt9固定化的PGUS-E对甘草酸的转化率分别为74.1%和56%,7个再生循环之后对甘草酸的转化率分别是62.7%和58%;利用aptamer自行构建了可以用于现PGUS-E微量检测的方法,该方法检测限低,操作简单,灵敏度高,检测速度很快;构建了利用aptamer对PGUS-E进行分离纯化的方法,与传统的镍离子亲和层析相比得到的PGUS-E具有更高的纯度和酶活性;同时aptamer可以对低丰度蛋白PGUS进行特异性识别和相互作用,可以用于PGUS的分离纯化。综上所述,基于核酸适配体的酶固定化方法可以实现PGUS-E的一步纯化固定化,稳定性强,操作简单,可回收再生利用,可作为新型酶固定化推广应用。