决明毛状根诱导培养体系优化及成分分析

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由于自然种植条件的限制,传统的中药种植技术对中药的产量和质量都有很大的影响。而在人为控制的条件下,可以在无激素培养基上培养大量生长快、遗传稳定的毛状根,毛状根中富含与原植物相当甚至更高含量的次生代谢产物。本论文通过研究不同的外植体及外植体龄,不同的预处理时间、共培养时间、除菌方法,不同的抗生素种类及浓度等对决明毛状根诱导和生长的影响,从而确定决明毛状根诱导培养的最适条件;并比较分析上述方法得到的毛状根和无菌实生根及决明子中的蒽醌、蛋白质、氨基酸、粗脂肪、脂肪酸、糖类及矿质元素的差异,为决明毛状根的批量培养体系的建立和优化提供理论指导。用于毛状根培养的培养基为MS基本培养基,基本的培养流程为:筛选饱满的种子→获取无菌苗→取外植体进行预培养→活化发根农杆菌→发根农杆菌浸染外植体→共培养→毛状根的诱导与除菌→毛状根无菌培养生长。比较决明毛状根、实生根及决明子中化学成分的方法:用混合碱液法测定蒽醌含量;考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白;日立L—8800型全自动氨基酸分析仪测定游离及水解氨基酸;SZF-06A粗脂肪测定仪测定粗脂肪含量;气相色谱仪(岛津GC2100)测定脂肪酸;3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖和总糖,蒽酮法测定可溶性糖;TA5-990型原子吸收分光光度计测定矿质元素。通过以上试验,得到以下结论:(1)培养决明毛状根的最适条件将籽粒饱满的决明子用浓硫酸浸泡10分钟,无菌处理后置于MS培养基中,在25℃,16h光照(1800Lx),8h黑暗条件下培养,7天后,在决明无菌幼苗上取子叶形态学的下半部作为外植体,在浓度为OD600=0.5的菌液中浸湿后立刻取出,共培养2-3 d,然后用添加了100 mg/L羧苄青霉素的MS培养基进行除菌,此时决明毛状根的诱导率最高,且后续生长最好。(2)决明毛状根、实生根及决明子中的化学成分差异以干重计,决明毛状根中结合蒽醌和游离蒽醌含量(0.112%,0.119%)低于实生根(0.187%,0.232%)及决明子(0.286%,0.629%);可溶性蛋白含量为130.38mg/g均高于实生根(40.96 mg/g)和决明子(18.60 mg/g);水解和游离氨基酸含量(23.562 g/100g,4878.800 mg/100g)均高于实生根(14.212 g/100g,940.959mg/100g)和决明子(15.216 g/100g,240.514 mg/100g),三种材料中的水解必需氨基酸含量分别为4.362 g/100g、5.019 g/100g和5.616 g/100g,相差不大,但毛状根中的游离必须氨基酸含量(422.928 mg/100g),显著高于实生根(250.429mg/100g)和决明子(158.248 mg/100g);毛状根中粗脂肪含量(1.91%)低于实生根(2.32%)和决明子(15.69%);不饱和脂肪酸(70%)低于实生根(75.4%)和决明子(75.7%);总糖、还原糖和可溶性糖含量分别为635.19 mg/g、58.88 mg/g和39.92 mg/g,均显著低于实生根(755.25 mg/g、84.46 mg/g、75.17 mg/g),但比决明子稍高(619.32 mg/g、45.53 mg/g、34.76 mg/g),差异不显著;矿质元素在三种材料中均以Mg的含量为最高,分别为999.68、772.34、1221.563 gg/g;毛状根中Mg和Ca含量高于实生根,但低于决明子。毛状根中Fe、Mn、Zn的含量显著高于实生根和决明子,Cu含量与实生根相当,但低于决明子。
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