牛初乳含有丰富的牛免疫球蛋白G(IgG),具有重要的保健功能。衡量牛初乳质量的关键指标是其中牛免疫球蛋白G(IgG)的含量,其检测方法目前主要有仪器分析法和免疫分析法等,但其各自存在一定的不足。仪器分析方法如高效液相色谱法对人员操作要求较高,基层推广难度较大;免疫检测方法是国际公认具有灵敏快速的快速检测方法,但目前应用于牛IgG免疫检测的免疫扩散法耗时长,分析结果精确性差。国内关于牛IgG酶联免疫检测技术也有报道,但到目前为止,还没有成熟的产品出现,无法服务于实际检测。为此,本论文较系统地开展了牛IgG免疫检测方法的研究及产品开发。主要研究内容及结果如下:　　 Ⅰ 牛免疫球蛋白G保守区(Fc片段)的单克隆抗体的制备　　 通过木瓜蛋白酶水解牛IgG标准品,经过透析、凝胶纯化制备了牛IgG的Fc段,并以此为免疫原免疫Balb/C小鼠制备单克隆抗体。第四次免疫后测定效价,按照经典方法进行细胞融合,筛选阳性细胞株。5只小鼠经多次免疫后,1、2、4号小鼠血清效价均达到1∶3000(OD450nm＞1.0)。细胞融合后,筛选得到6株杂交瘤细胞株,抗体亚型分别为IgG1、IgG2a、IgG2a、IgG1、IgG2b和IgE。其中1～5株抗体灵敏度(以50％抑制浓度IC50表示)分别为0.089、0.598、0.184、0.274、0.007μg/mL,综合考虑选择灵敏度为0.598μg/mL、亚型为IgG2a的单克隆抗体用于后续实验方法建立。以牛IgG、牛血清白蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、阴性乳粉(IgG＜0.1％)和乳铁蛋白等对其进行交叉反应测定,结果表明该抗体特异性良好,与牛IgG以外的其他蛋白无显著交叉反应(＜1％)。　　 Ⅱ 牛免疫球蛋白G间接竞争酶联免疫方法的建立及试剂盒的制备　　 通过测定抗体效价,初步确定了抗原、抗体的工作浓度,以此为基础对酶标板的包被工艺进行优化。工艺确定后,对酶联免疫分析方法各个环节的工作温度、缓冲溶液体系再次进行优化组合。并以牛IgG标准品对阴性乳粉样品进行添加,进行方法评估,并与国标法(HPLC)法进行对比。牛IgG抗原包被浓度为0.5μg/mL,单克隆抗体稀释比例为1∶5×105,包被工艺确定为37℃下2h,包被液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6),单抗稀释液、标准品稀释液为0.01mol/L pH17.4的PBS,标准品和抗体溶液体积比为50μL∶50μL,竞争反应时间为15min。方法初步确立的标准曲线线性良好,相关系数大于0.99。模拟样品添加牛IgG标准品的测定结果表明该方法的回收率在75.8％～96.9％,变异系数为7.3％～10.4％。11份用HPLC国标法进行测定的样品,用本方法分析的结果显示两种方法检测结果高度相关(R＞0.97),且差异不显著(P＜0.01)。　　 Ⅲ 牛免疫球蛋白G免疫亲和层析柱(IAC)的制备及其性能评估　　 通过重组蛋白G柱纯化抗牛IgG单克隆抗体后用随机偶联的方法偶联至溴化氰活化的Sepharose 4B上,进行亲和层析柱填充制备。完毕后对其进行初步评价,包括测定柱容量、回收率及再生利用等,初步建立了牛免疫球蛋白G测定的IAC-ELISA.及IAC-HPLC方法。牛IgG单克隆抗体的偶联率为94.8％,平均每毫升凝胶偶联抗体为9.9mg。IAC柱的动态柱容量为668μg/mL凝胶,绝对柱容量为67.4μg/mg抗体,回收率为78.6％～92.6％,变异系数小于10％。经15次重复测定后,IAC柱回收率从93.5％下降至72.3％。IAC-ELISA法回收率为91.9％～94.6％。IAC-HPLC法回收率为97.6％～99.1％,变异系数均小于10％。另外,对国标法GB/T 5009.194进行评估可知,由于国标法中的Hi-Trap蛋白G柱适用于标准品及组分单一的样品纯化,柱容量较小,在测定牛初乳样品时容易过饱和,重复性差,提高稀释倍数后又容易放大误差。而且,国标法无法识别IgG成分是否是牛源,当存在其它来源IgG成分掺假的情况下容易产生测定误差,因此亟待修订。　　 Ⅳ 牛IgG荧光偏振免疫分析检测技术建立　　 通过摸索,初步建立了牛IgG的竞争性荧光偏振免疫分析方法。单克隆抗体稀释1∶10000倍,荧光素标记牛IgG浓度为1μg/mL,缓冲液为pH7.4,0.1mol/L的PBS溶液时,该方法对牛IgG的最低检测限为0.97μg/mL,半抑制浓度为29.12μg/mL,标准曲线线性范围为2.05～43.91μg/mL。阴性添加样品测定结果与ELISA相比无显著差异。