T7核酸内切酶I（T7 Endonuclease I, T7 Endo I）是一种研究非常深入的多功能核酸内切酶,由大肠杆菌T7噬菌体基因3编码。T7 Endo I具有底物结构特异性,主要作为解离酶（resolvase）参与重组过程中Holliday junction结构的解离。该酶同时具有随机切刻（random nicking）活力,随机地在双链DNA上的一条链上引入切口;切刻位点对位切刻（counter nicking）活力,在具有切口的双链DNA的切口相对的链附近将双链切断;以及单核苷酸错配识别活力。研究发现T7 Endo I具有Mg2+依赖性,Mn2+可以作为替代离子,但是在两种离子中酶活的表现不同。T7 Endo I家族（T7-like Endo I）的核酸酶具有广泛的用处,可以用于SNP的检测,基因组的随机片段化,恒温PCR扩增技术等。因此该家族蛋白结构和功能的深入研究具有重大的意义。P-SSP7 Endo I和Syn5 Endo I是蓝细菌噬菌体中的T7 Endo I同源蛋白,研究发现这三个核酸酶具有基本相同的结构和酶学特征,但有所不同。同T7 Endo I序列比较发现,P-SSP7 Endo I和Syn5 Endo I的N-端和C-端都短了一段肽段。其中C-末端的肽段对T7 Endo I的活性是必须的。同时在结构域连接的β-bridge中间位置缺失了三个连续的氨基酸残基。三种核酸酶都具有相同PD-（E/D）XK基序特征,活性中心氨基酸残基组成完全一致,分别是Glu、Asp、Glu和Lys。T7 Endo I、P-SSP7 Endo I和Syn5 Endo I的空间结构均为由β-bridge连接的结构域交换（domain-swapping）同源二聚体,具有两个催化结构域,催化中心由一个亚基的D55、E65和K67氨基酸残基和另一个亚基的E20共同构成,两个催化结构域既可以协同作用作为解离酶,又可以独立作为内切核酸酶作用。本研究的目的在于根据T7-like Endo I结构域交换和催化结构域由两个亚基组成的结构特征,构建T7 Endo I和P-SSP7 Endo I的杂合分子,使其分别具有一个分子的N-段部分和另一个分子的C-段部分,再通过原核共表达使两个杂合分子进一步形成杂合二聚体,然后分析该杂合二聚体的酶活特性,比较其与T7 Endo I和P-SSP7 Endo I的活性。基于该家族酶的结构和催化特征,本研究以pET21a-MBP-T7（pM-T7）和pET21a- MBP- P-SSP7（pM-P-SSP7）质粒载体中T7 Endo I和P-SSP7 Endo I的基因为模板,设计引物序列。利用融合PCR技术,通过两步PCR扩增获得了融合基因TP（ΔPAS）和PT（ΔPAS）,构建了重组质粒pET28a-His-TP（ΔPAS）和pET21a-MBP-PT（ΔPAS）。将两个重组质粒共表达,再依次利用Amylose和Ni-NTA亲和层析纯化获得带有双标签的杂合二聚体His-TP（ΔPAS）/MBP-PT（ΔPAS）（TP*）。随后对该杂合二聚体TP*在Mg2+和Mn2+中的解离酶活力、随机切刻活力、切刻位点对位切刻活力、单核苷酸错配识别活力做了详细的分析。本研究首次证明了可以通过融合技术获得杂合二聚体形式的T7-like Endo I。实验证明该杂合二聚体基本保持了以上所有活性,在两种金属离子缓冲液中表现出不同的活力特点,在Mg2+中主要表现出高解离酶活力和切刻位点对位切刻活力,分别是其在Mn2+中活力的大约4倍和8倍;在Mn2+中主要表现出强随机切刻活力,是其在Mg2+中活力的大约8倍,还有很好的单核苷酸错配识别活性,几乎识别所有的错配类型。研究发现该杂合二聚体具有自己的活性和金属离子依赖特征,并不是T7 Endo I和P-SSP7 Endo I的特征的中和或者叠加。本研究的实验成果为以后构建更多的具有特异功能的杂合二聚体核酸酶提供了新的思路,并且为通过分别表达后变性复性获得高浓度的细胞毒性蛋白T7-like Endo I杂合二聚体提供了实验依据。