镉是广泛存在于自然环境中的重金属污染物,通过消化系统和呼吸系统等途径进入机体造成多器官和系统的损伤。骨骼是镉重要的靶器官之一,镉暴露可导致骨质密度降低、骨质疏松和骨折发生率增加,但其致病机制尚不明确。p53在调控细胞周期阻滞、细胞凋亡和DNA修复等过程中发挥重要作用。然而,p53在成骨细胞凋亡中的作用尚未见报道。基于此,本文以原代大鼠成骨细胞为模型,研究镉对p53的活化、线粒体凋亡通路和氧化性DNA损伤的影响,并探讨氧化性DNA损伤在p53及其介导的线粒体凋亡通路激活中的作用,旨在为阐明镉致成骨细胞毒性损伤的分子机制提供科学依据。1.镉对大鼠成骨细胞增殖和凋亡的影响为探究镉对成骨细胞凋亡和增殖的影响,用不同浓度镉(0、1、2和5 μmol/L)处理成骨细胞6h或12 h,通过光学显微镜观察细胞形态,流式细胞术检测凋亡率和细胞周期,实时细胞分析技术(RTCA)监测细胞增殖率,Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果显示,与对照组相比,2 μmol/L和5 μmol/L镉处理组均可见细胞变圆、漂浮等形态学改变;细胞凋亡率显著增加(p<0.01);所有处理组均显示 Cleaved caspase-9、Cleaved caspase-3、p53、PUMA 和 Noxa 蛋白表达上调(p<0.05或p<0.01);在≥2 μmol/L镉处理组均显示Bax/Bcl-2比值和胞浆蛋白Cyto c表达上调(p<0.01);细胞增殖率显著降低,G0/G1期细胞的比例增加,S期细胞比例减少(p<0.05或p<0.01);此外,染镉12h时,5μmol/L镉处理组G2/M期细胞数增加(p<0.05)。表明镉可以抑制成骨细胞增殖,激活p53和线粒体凋亡相关蛋白,诱导细胞凋亡,p53和线粒体凋亡通路可能参与镉致大鼠成骨细胞凋亡的调控。2.镉通过激活p53介导的线粒体凋亡通路诱导成骨细胞凋亡为了明确p53介导的线粒体凋亡通路在镉致成骨细胞凋亡中的作用,首先用2 μmol/L镉处理成骨细胞不同时间(0、1、3和6h),采用免疫荧光技术检测p53细胞核转位情况;然后,p53转录活性抑制剂(PFT-α)和镉单独或联合处理细胞6 h或12 h后,通过流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体膜电位,RTCA检测细胞增殖率,Western Blot检测p53和线粒体凋亡相关蛋白的表达。结果显示,随着染镉时间延长,p53在细胞核荧光聚点逐渐变强;与镉组比较,PFT-α与镉共处理组细胞凋亡率显著下降(p<0.01);细胞增殖率显著提高;p53、PUMA、Noxa、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达均显著降低(p<0.05或pp<0.01);此外,线粒体膜电位也较镉单独处理组显著升高(p<0.01)。表明p53介导的线粒体凋亡通路确实参与了镉诱导的成骨细胞凋亡的调控。3.镉对成骨细胞氧化性DNA损伤和细胞凋亡的影响为了研究氧化性DNA损伤在p53激活和细胞凋亡中的作用,镉与NAC单独或联合处理细胞,通过流式细胞术检测H2O2和O2的含量,试剂盒检测细胞丙二醛(MDA)水平,免疫荧光技术检测p-H2AX和p53核转位,Western Blot检测p-H2AX、p53和凋亡相关蛋白的表达。结果显示,与对照组相比,镉处理细胞15 min后,各处理组H2O2含量显著升高(p<0.05或p<0.01);然而,镉处理细胞6h后,各处理组H2O2含量显著下降(p<0.01),但细胞内O2-水平极显著升高(p<0.05或pp<0.01),MDA含量无显著性差异(p>0.05);镉能引起成骨细胞p-H2AX蛋白水平显著升高(p<0.01),且在细胞核形成荧光聚点;与镉组比较,NAC与镉组共处理组p-H2AX、p53和凋亡相关蛋白的表达显著降低(p<0.01);p-H2AX和p53核聚点形成减少。以上结果表明,镉处理使细胞ROS过度产生,诱导DNA损伤,激活p53,最终导致细胞凋亡。NAC具有一定的保护作用。综上所述,镉使大鼠成骨细胞ROS过度产生,诱导DNA损伤,激活p53,p53通过转录活性诱导促凋亡蛋白的表达,促凋亡蛋白作用于线粒体,使线粒体膜电位降低,凋亡因子释放,最终导致细胞凋亡。