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背景肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是种常见胃肠道功能紊乱性疾病,它在全球范围内发病率较高。IBS发病机制目前研究尚不明确,许多环节均可能参与到IBS发生发展过程,包括肠道免疫系统、肠道微生物、脑肠轴等。虽然,IBS发病机制复杂,但是患者往往伴有两大显著病理生理特点,即内脏敏化和胃肠运动异常;这两大特点和IBS患者腹痛、腹泻、便秘等症状密切相关。因此,弄清楚内脏敏化和胃肠运动异常的发生机制,将有助于我们更深入认识IBS疾病,并促进其临床的诊断和治疗。目前,许多研究表明胃肠道粘膜低度炎症以及SCF/c-kit信号通路和IBS内脏敏化密切相关。而肥大细胞是目前研究比较多的可能参与IBS低度炎症反应的免疫细胞。因此,有研究提出IBS易感因素可以引起肥大细胞在胃肠粘膜浸润,同时诱发肠道平滑肌细胞大量合成并释放干细胞因子(Stem cell factor,SCF)。SCF作用于肥大细胞膜表面特异性受体C-KIT,进一步促进肥大细胞在肠道局部增生。肥大细胞增生并脱颗粒释放多种炎症介质,引发肠道粘膜屏障改变、肠内神经损伤等一系列效应,最终参与IBS内脏敏化的发生发展。但是许多临床研究表明,肥大细胞膜稳定剂并不能很好缓解IBS内脏敏化和肠动力异常相关症状。因此,肥大细胞是否参与IBS内脏敏化以及肠动力异常的发生过程,还需进一步研究加以阐明。Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)作为胃肠道起搏细胞,是胃肠动力重要的调控者。越来越多研究将它和胃肠动力紊乱性疾病联系在一起,其中就包括IBS。而前面提到和IBS内脏敏化息息相关的SCF/c-kit信号通路,也参与ICC增殖和活化,是维持ICC正常形态和功能所必须的。因此,ICC是否参与IBS内脏敏化;SCF/c-kit信号通路到底是通过ICC还是通过肥大细胞来参与调控IBS内脏敏化的发生过程;以及ICC和肥大细胞在内脏敏化发生发展过程中各自扮演什么角色等系列问题很值得我们深入研究。弄清楚这些问题将有助于我们进一步理解IBS内脏敏化的发生机制,并极大促进IBS的临床诊断和治疗。针对以上的问题,我们计划先后通过使用肥大细胞膜稳定剂--色甘酸钠(disdium cromogly cate,DC)抑制肥大细胞脱颗粒以及抑制ICC增殖,分别来探究肥大细胞、ICC在IBS内脏敏化中所起的作用;同时进一步探究骶髓后连合核(Dorsal commissural nucleus,DCN)是否也参与到IBS内脏敏化过程,及其和ICC之间的关联。而且我们还将通过系列实验进一步探究IBS内脏敏化潜在的解剖微结构基础、分子生物学基础以及电生理学基础,最终为深入理解IBS内脏敏化以及肠动力异常的发生机制提供一个全新的角度。目的1.第一阶段:探究肥大细胞、ICC、DCN在IBS内脏敏化中所起的作用。2.第二阶段:在第一阶段实验的基础上进一步探究与IBS内脏敏化密切相关的超微结构基础、分子生物基础以及电生理机制。方法1.第一阶段实验:(1)本阶段实验将大鼠分为7组,分别为正常组、正常+结肠扩张组、IBS组、IBS+结肠扩张组、IBS+STI-571+结肠扩张组、IBS+DC+结肠扩张组、IBS+STI-571+DC+结肠扩张组。(2)通过检测大鼠腹直肌肌电来观察各组大鼠腹痛反应强度,通过检测脊髓DCN放电频率来观察各组DCN的兴奋情况;通过免疫荧光染色来检测各组大鼠胃肠道ICC增殖活化的情况;2.第二阶段实验:(1)运用免疫电镜探究正常大鼠和IBS大鼠胃肠道ICC超微结结特点,为IBS内脏敏化提供形态学基础(2)运用免疫荧光染色和Western blotting方法,比较正常大鼠和IBS大鼠ICC内HCN1蛋白表达水平的差异,为IBS内脏敏化提供分子生物学基础(3)通过腹直肌肌电与DCN放电检测、细胞膜片钳技术并结合药理实验,探究HCN1在IBS内脏敏化中的作用,为IBS内脏敏化提供电生理学基础。结果1.第一阶段实验:(1)IBS大鼠腹直肌以及DCN放电频率和幅度高于正常大鼠(P<0.05)(2)结肠扩张刺激可以进一步提高正常大鼠和IBS大鼠腹直肌和DCN放电频率,但是对IBS大鼠作用更明显(P<0.05)(3)肥大细胞膜稳定剂DC并不能有效阻断结肠扩张刺激诱发IBS大鼠腹直肌和DCN放电频率(P>0.05)(4)用STI-571抑制ICC增殖后,可以显著抑制结肠扩张刺激诱发IBS大鼠腹直肌和DCN放电频率(P<0.05)(5)IBS大鼠胃肠道ICC密度高于正常大鼠(P<0.05);DC对ICC增殖活化并不影响,而STI-571可以有效抑制ICC增殖活化。2.第二阶段实验:(1)电镜下可见正常大鼠胃肠道ICC和肠内神经元之间存在有突触样结构;IBS大鼠ICC细胞明显萎缩,突起减少,可见有碎片,线粒体出现明显的萎缩以及内质网脱颗粒改变(2)免疫荧光和Western blotting结果显示IBS大鼠HCN1表示水平高于正常大鼠(P<0.05)(3)电生理实验和药理实验结果显示:HCN1选择性阻断剂ZD7288可以有效阻断IBS大鼠腹直肌和DCN放电;细胞膜片钳结果显示IBS大鼠ICC膜电位有长时程增强现象,而这一现象可以被HCN1阻断剂阻断,或被HCN1激动剂c AMP激发并增强结论IBS大鼠对结肠扩张刺激的反应明显高于正常组,说明IBS大鼠存在明显内脏敏化;而抑制肥大细胞脱颗粒并不能降低IBS大鼠对结肠扩张刺激的反应强度,说明肥大细胞并不是IBS内脏敏化的主要参与者;IBS大鼠胃肠道ICC密度明显高于正常大鼠,抑制ICC增殖可以有效降低IBS大鼠对结肠扩张刺激的反应强度,说明ICC是IBS内脏敏化的主要参与者。同时第一阶段电生理实验还证实DCN参与IBS内脏敏化的过程。在第二阶段实验中,我们进一步发现IBS内脏敏化和ICC超微结构改变以及HCN1表达上调有关。在IBS大鼠胃肠道中,ICC增殖活性增强,HCN1表达上调并过度激活形成LTP现象;异常LTP电信号可以上传到脊髓DCN,导致DCN异常兴奋并形成异常神经冲动;神经信号可以上传到大脑中枢或下传到胃肠道效应器,进一步加剧内脏感觉异常和胃肠运动异常。