卵巢衰老尤其是早发型卵巢衰老(Premature Ovarian Aging, POA)伴随着卵巢产生卵子的能力减弱,卵母细胞质量下降是导致女性不孕的主要原因之一极大威胁着女性的生殖健康。既往对卵巢衰老的研究主要集中于寻找出可以预测、评判卵巢功能的指标,然而关于卵巢功能下降的确切机制研究甚少。普遍认为年龄是影响卵巢功能的最重要因素。但是卵巢衰老的发生存在着极大的个体差异性,提示我们卵巢的内部因素比年龄更能决定生育储备功能。卵泡的生长发育异常、颗粒细胞的凋亡加速导致卵泡闭锁是卵巢储备功能下降的根本原因。研究参与调节卵泡生长发育、闭锁过程的基因对于揭示卵巢储备功能下降的机制有着重要意义。有关阿尔茨海默病(Alzheimer Disease,AD)的研究发现AD模型中的转基因小鼠均出现不育,在AD中发挥关键性作用的淀粉样前体蛋白(Amyloid Precursor Protein, APP)及其代谢产物的水平升高。APP蛋白属I型膜整合糖蛋白,经β和γ分泌酶连续裂解的过程中,APP被p分泌酶(p-site APP cleaving enzyme1, BACE1)水解产生一种APP羧基末端片段(C-terminal fragment,CTF)---C99。C99包含一个完整的β样淀粉蛋白(Amyloid β peptide,Aβ)序列,随后在跨膜区内被γ分泌酶裂解生成具有神经毒性的Ap。BACE1几乎在人体所有的组织器官中均有表达,它是在APP的淀粉样分解途径中发挥关键作用的分泌酶,也是Aβ产生过程中的限速酶。Ap的产生、聚集和沉积被认为是AD发病机制的首要和中心环节。已证实转基因小鼠中APP的高表达及其代谢产物Aβ的增加使细胞更易受到氧化应激的损伤、降低细胞的抗凋亡能力并导致细胞死亡,提示APP及其代谢产物可能通过增加细胞对氧化应激的敏感性、诱导细胞凋亡的途径对卵巢内卵泡的生长发育和凋亡以及卵巢功能产生影响,而关于APP蛋白在卵巢衰老中作用的研究尚属空白。本研究拟采用分子生物学方法,从蛋白和基因水平探索APP蛋白、APP淀粉样裂解途径关键酶(BACE1)及凋亡调控基因Bcl-2家族成员在卵巢衰老患者的颗粒细胞中的表达情况,APP代谢产物Aβ42在卵泡液中的表达水平,分析其与卵子、胚胎数量和质量以及体外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilization Embryo Transfer, IVF-ET)临床结局的关系,探索APP及其代谢产物介导卵巢储备功能下降发生的可能分子机制,为预防和治疗卵巢衰老、卵巢储备功能下降提供理论依据。第一部分淀粉样前体蛋白在卵巢颗粒细胞中的表达及与IVF结局的相关性研究研究目的：检测行IVF/ICSI-ET治疗的不孕症患者的卵巢壁层颗粒细胞中APP的蛋白和基因表达水平,并分析其在不同年龄患者中的表达差异及与IVF结局的相关性,研究APP蛋白在卵巢颗粒细胞中的表达情况,并试图探索其与卵巢衰老发生的关系。研究方法：1.收集自2012年12月-2013年9月于南方医科大学南方医院生殖医学中心行IVF/ICSI-ET治疗的不孕症患者的卵泡液,共192例。均为输卵管因素或男性因素不孕症患者。2.将收集的所有卵泡液采用Percoll密度梯度离心法分离提纯卵巢壁层颗粒细胞,用红细胞裂解液裂解其中存在的红细胞以减少实验干扰。3.选取67例样本进行蛋白质免疫印迹法(Western Bblot)检测APP蛋白的表达水平,按患者年龄将壁层颗粒细胞蛋白组分为：A组：<35岁,B组：》35岁&<40岁,C组：》40岁；选取138例进行实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测APPmRNA的表达水平,按患者年龄将壁层颗粒细胞基因组分为：A1组：<35岁,B1组：》35岁&<40岁,C1组：》40岁。4.收集所有标本的临床资料,采用SPSS16.0统计软件分析比较各组中APP的表达水平及其与年龄、基础窦状卵泡数(Antral Follicle Count, AFC)、获卵数、正常受精数、胚胎数等临床参数的相关性,设定检验水准a=0.05,P<0.05认为差异有统计学意义。研究结果：1.壁层颗粒细胞中APP蛋白组：各组间年龄、AFC、Gn总量、获卵数、正常受精数、胚胎数均存在差异,具有统计学意义；／APP mRNA组：各组间年龄、AFC、HCG日E2水平、Gn总量、获卵数、正常受精数、胚胎数均存在差异,具有统计学意义(P<0.05)。2.与低龄组相比,APP在中、高龄组壁层颗粒细胞中的蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义(1.12±0.75,2.02±1.17VS3.47±1.22,P<0.05)；APPmRNA水平随年龄增加也明显升高,差异具有统计学意义(1.88±1.34,3.58±2.58VS6.59±6.54,P<0.05)；3.壁层颗粒细胞中APP的蛋白表达水平与年龄呈正相关关系(r=0.646,P=0.000)；与AFC、获卵数及胚胎数呈负相关关系(r=-0.553,P=0.000;r=-0.601,P=0.000；r=-586,P=0.000)；APP的基因表达水平与年龄呈正相关关系(r=0.488,P=0.000)；与AFC、获卵数及胚胎数呈负相关关系(r=-0.189,P=0.026;r=-0.175,P=0.040;r=-0.177,P=0.037)。研究结论：1.卵巢壁层颗粒细胞中表达APP蛋白。随着年龄增加,APP蛋白在卵巢颗粒细胞中的积累增加,可在一定程度上预测卵巢衰老。2.卵巢颗粒细胞中APP的基因和蛋白表达水平与基础窦状卵泡数、获卵数均呈负相关关系,提示APP的表达异常可能会影响卵巢储备功能。第二部分淀粉样前体蛋白及其代谢产物影响卵巢衰老发生的相关性研究研究目的：检测卵巢储备功能不同患者的壁层颗粒细胞中APP、BACE1、Bcl-2及Bax的基因表达情况与卵泡液中Aβ42的水平,并分析各基因间的相关性及各基因与IVF结局的相关性,研究APP及其代谢产物介导卵巢功能下降的可能机制。研究方法：1.收集自2012年12月-2013年9月于南方医科大学南方医院生殖医学中心行IVF/ICSI-ET治疗的不孕症患者的卵泡液,共80例。2.将收集的所有卵泡液采用Percoll密度梯度离心法分离提纯卵巢壁层颗粒细胞,用红细胞裂解液裂解其中存在的红细胞以减少实验干扰。收集第一管清亮卵泡液,离心取上清分装冻存,备用。3.根据患者年龄及卵巢功能评估指标(bFSH、AMH)分组：①早发型卵巢衰老／隐匿性原发性卵巢功能不全(POA/OPOI)组：年龄<38岁,bFSH>10IU/L或AMH<1.1ng/ml,19例；②生理性卵巢储备功能下降(DOR)组：年龄》40岁,29例；③卵巢储备功能正常(NOR)组：年龄<38岁,bFSH<10IU/L或AMH>1.1ng/ml,32例。4.应用qRT-PCR检测APP、Bax、Bcl-2及BACE1在颗粒细胞中的基因水平,酶联免疫吸附测定(ELISA)定量测定卵泡液中Aβ42水平。5.收集所有标本的临床资料,采用SPSS16.0统计软件分析比较各组中APP的表达水平及其与年龄、AFC、获卵数、正常受精数、胚胎数等临床参数的相关性,设定检验水准a=0.05,P<0.05认为差异有统计学意义。研究结果：1.三组的年龄、基础FSH、AFC、HCG日E2水平、获卵数、正常受精数及胚胎数相比有差异,具有统计学意义。进一步进行两两比较发现：POA组与NOR组的年龄相比,差异无统计学意义；POA组与DOR组的AFC、HCG日E2水平、获卵数、正常受精数及胚胎数比较,差异无统计学意义。2.与NOR相比,POA组及DOR组APP、BACE1、Bax mRNA水平升高,Bcl-2水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)；与POA组相比,DOR组的APPmRNA表达量显著升高,BACE1、Bcl-2、BaxmRNA的表达量略低,差异无统计学意义(P>0.05)。3.采用相关系数进行相关分析发现：APPmRNA与BACE1、Bax的表达呈正相关关系,与Bcl-2的表达呈负相关关系,具有统计学意义(P<0.05)；APP、BACE1基因的表达与年龄呈正相关关系,Bcl-2的表达与年龄呈负相关关系；APP、BACE1、Bax基因的表达与AFC呈负相关关系,Bcl-2的表达与AFC呈正相关关系；APP、BACE1基因的表达与获卵数呈负相关关系；BACE1、Bax基因的表达与胚胎数呈负相关关系,均具有统计学意义(P<0.05)。4.与NOR相比,POA组及DOR组Aβ42水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)；POA组的Aβ42的水平略高于DOR组,差异无统计学意义(P>0.05)。5.采用相关系数进行相关分析发现：Aβ42与BACE1的表达呈正相关关系(r=0.359,P=0.004),与Bcl-2及获卵数呈负相关关系(r=-0.265,P=0.039；r=-0.341,P=0.007)。研究结论：1.卵巢壁层颗粒细胞中APP、BACEl基因及卵泡液中Aβ42的表达水平增加可能与卵巢储备功能下降有关。2.高表达的APP可能通过降低卵巢颗粒细胞内的Bcl-2水平,从而影响卵泡的形成、颗粒细胞的生长与凋亡及卵母细胞的发育成熟,这可能是APP及其代谢产物参与卵巢衰老发生的机制之一。