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肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是最常见的成人发病的运动神经元疾病,其特征在于运动神经元的选择性丢失,导致全身进行性肌肉萎缩、肌无力、肌束颤动、肌肉痉挛、语言障碍、吞咽困难和反射改变。其中散发性ALS(Sporadic ALS,SALS)约占90-95%,家族性ALS(Familial ALS,FALS)占5-10%。ALS发病机制不清,一般认为是基因突变与环境因素相互作用的结果。氧化损伤、细胞骨架异常、自噬异常、细胞凋亡、兴奋性谷氨酸毒性、免疫异常等与其发病有关。目前该病缺乏有效的治疗方法,主要的治疗目的是延缓病情进展,改善生活质量。SOD1基因是首个被确诊的ALS致病基因,大约20%的家族性ALS和2-7%的散发性ALS与该基因突变有关。过表达人SOD1G93A突变的转基因小鼠是经典的ALS研究模型,而转染h SOD1G93A质粒的NSC34细胞(NSC34-h SOD1G93A细胞)也表现出SOD1蛋白聚积、细胞活力降低、增殖能力减弱、线粒体功能障碍,以及更加易感于氧化应激损伤,因此,该细胞模型已经被广泛应用于ALS的发病机制研究及药物筛选。以往研究显示,ALS患者存在代谢异常,病人在病程中体重下降会导致病情加重,高脂肪饮食可以延缓ALS小鼠的寿命,他汀类药物可以加重ALS的病情进展,但也有不同的研究结果,同时他汀类药物对ALS影响的机制不清。众所周知,他汀类药物作为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A,HMG-Co A)还原酶的抑制剂,由于具有降低血浆胆固醇水平的强大能力,被广泛用于心脑血管疾病的预防及治疗。因此,在本研究中,我们首先对我科近年来收治的ALS病人心脑血管疾病的危险因素进行分析,发现部分ALS病人存在高胆固醇血症或心脑血管疾病,需要他汀类药物治疗,接下来我们观察了辛伐他汀对NSC34-h SOD1G93A细胞(家族性ALS细胞模型)的影响,并对其可能的机制进行探讨。第一部分肌萎缩侧索硬化患者合并心脑血管疾病及危险因素的临床观察目的:回顾性观察分析ALS患者合并心脑血管疾病及危险因素的临床情况。方法:收集150例ALS患者的临床资料,观察ALS患者合并心脑血管疾病及危险因素的发生率,比较合并心脑血管疾病及危险因素的ALS患者与未合并的ALS患者的发病年龄有无差异。结果:1.ALS发病男性多于女性,发病年龄多在51-60岁,以上肢起病多见。2.ALS男性患者吸烟率低于全人群,合并冠心病、高胆固醇血症的发生率高于全人群。3.合并冠心病、高血压病的ALS患者发病年龄晚于无冠心病、高血压病的ALS患者。4.部分ALS患者合并冠心病、脑梗死及高胆固醇血症,有使用他汀类药物治疗的指征,因此有必要明确他汀类药物对ALS的影响。第二部分辛伐他汀导致NSC34-h SOD1G93A细胞的损伤目的:观察辛伐他汀对NSC34-h SOD1G93A细胞活力的影响。方法:1.通过稳定转染h SOD1G93A质粒,已经建立NSC34-h SOD1G93A细胞模型,验证细胞模型的成功构建。2.通过CCK-8、LDH法观察辛伐他汀对NSC34-h SOD1G93A细胞活力的影响。结果:1.免疫荧光染色结果显示三种细胞均表达运动神经元特异性抗体SMI-32,证实了NSC34细胞系的神经元特性;绿色荧光蛋白GFP和DAPI荧光几乎完全重合,western blot结果显示NSC34-E细胞仅表达GFP,而转染GFP-h SOD1WT和GFP-h SOD1G93A的细胞表达GFP-h SOD1融合蛋白,表明模型构建成功。2.随着辛伐他汀浓度的增加及干预时间的延长,NSC34-h SOD1G93A细胞活力明显下降,LDH释放增加,NSC34-E细胞和NSC34-h SOD1WT细胞的活力略有下降,但无统计学意义,证明NSC34-h SOD1G93A细胞模型易感于辛伐他汀的毒性,辛伐他汀导致NSC34-h SOD1G93A细胞的损伤呈浓度、时间依赖性。第三部分辛伐他汀加重NSC34-h SOD1G93A细胞的自噬流障碍目的:观察NSC34-h SOD1G93A细胞的自噬流情况以及辛伐他汀对NSC34-h SOD1G93A细胞自噬流的影响。方法:应用透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)观察细胞中自噬结构的情况,应用western blot检测自噬标记物LC3 II/I和P62蛋白的表达水平。结果:1.与NSC34-E细胞、NSC34-h SOD1WT细胞相比,NSC34-h SOD1G93A细胞中自噬结构的数量增多,LC3 II/I、P62蛋白的表达水平增加,应用巴弗洛霉素A1处理后,三种细胞的LC3 II/I和P62表达水平都显著升高,表明NSC34-h SOD1G93A细胞模型存在不完全的自噬流障碍。2.辛伐他汀处理后,NSC34-h SOD1G93A细胞中自噬结构明显增多,LC3 II/I、P62蛋白的表达水平也显著增加并且呈浓度、时间依赖性。比较辛伐他汀联合巴弗洛霉素A1处理组和单独使用辛伐他汀或巴弗洛霉素A1处理组,三组细胞的LC3 II/I和P62表达水平无明显差异,结果表明辛伐他汀进一步加重了NSC34-h SOD1G93A细胞的自噬流障碍。第四部分辛伐他汀通过抑制GGPP的合成加重NSC34-h SOD1G93A细胞的自噬流障碍,导致NSC34-h SOD1G93A细胞的损伤目的:观察补充甲羟戊酸途径的下游产物,能否影响辛伐他汀产生的细胞作用效应,以及甲羟戊酸途径下游抑制剂对NSC34-h SOD1G93A细胞的影响。方法:1.辛伐他汀联合甲羟戊酸、胆固醇、FPP或GGPP处理NSC34-h SOD1G93A细胞,应用CCK-8、LDH法检测细胞活力的改变,应用TEM观察细胞中自噬结构数量的变化,western blot检测自噬标记物LC3 II/I和P62蛋白表达水平的变化。2.应用AY9944、FTI-277、GGTI-286处理NSC34-h SOD1G93A细胞,应用CCK-8法检测细胞活力,western blot检测自噬标记物LC3 II/I和P62蛋白的表达水平。结果:1.分别补充甲羟戊酸、FPP或GGPP均可明显改善辛伐他汀导致的细胞损伤和增加的LC3 II/I和P62水平,明显地减少辛伐他汀诱导增加的自噬结构数量,但是补充胆固醇却不能明显改善辛伐他汀的作用,表明辛伐他汀导致NSC34-h SOD1G93A细胞的损伤及加重NSC34-h SOD1G93A细胞的自噬流障碍可能是因为抑制了甲羟戊酸途径的FPP或GGPP合成,而非胆固醇。2.GGTI-286可以引起NSC34-h SOD1G93A细胞活力下降,而AY9944对细胞活力无明显影响,FTI-277引起细胞活力略有下降,但无统计学意义。GGTI-286可以诱导NSC34-h SOD1G93A细胞中LC3 II/I和P62表达水平升高。进一步提示辛伐他汀加重NSC34-h SOD1G93A细胞的自噬流障碍,导致NSC34-h SOD1G93A细胞的损伤可能是由于抑制了GGPP的合成。结论:1.NSC34-h SOD1G93A细胞更加易感于辛伐他汀的细胞毒性。辛伐他汀导致NSC34-h SOD1G93A细胞的损伤呈浓度、时间依赖性。2.辛伐他汀加重NSC34-h SOD1G93A细胞的自噬流障碍呈浓度、时间依赖性。3.辛伐他汀加重NSC34-h SOD1G93A细胞的自噬流障碍、导致NSC34-h SOD1G93A细胞的损伤是因为抑制GGPP的合成导致的。4.合并冠心病、脑梗死及高胆固醇血症的ALS患者应用他汀类药物时要慎重。