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有机废水发酵法生物制氢技术具有能源回收与环保的双重优势,因此具有广阔的应用前景。产氢产乙醇发酵是产氢细菌中已知的主要产氢代谢途径之一,哈尔滨产乙醇杆菌(Ethanoligenens harbinense)是产氢产乙醇发酵的代表性产氢菌,也是乙醇型发酵产氢反应器的优势功能菌,然而目前该种属代谢的分子调控机制研究还未有效开展。本论文以E.harbinense的模式菌株YUAN-3为研究材料,采用定量蛋白质组学与乙酰化修饰蛋白组学研究策略,从分子水平上分析了菌株在不同生态因子作用下的蛋白质组变化,系统解析了菌株代谢调控和响应机制,为规模化乙醇型发酵制氢及其精准定向调控提供技术与理论支撑。乙酸是E.harbinense的两种液相代谢产物之一,也是抑制产氢发酵过程的主要因素之一,为了揭示乙酸抑制菌株YUAN-3发酵进程的机制,首先,本研究根据含不同浓度乙酸的PYG培养基的p H变化趋势,选择了10、20与30 m M的乙酸添加浓度,考察了菌株YUAN-3在不同浓度乙酸作用下的发酵产氢特性。结果显示,乙酸浓度的增加虽然没有显著影响各种代谢产物的产量,但是却降低了菌株的产气速率,延长了发酵时间。其次,建立与优化了蛋白质组分析样品的制备方法。结果表明,匀浆破碎法与苯酚抽提法联用的方法更适用于E.harbinense的蛋白质组分析样品制备。最后,利用定量蛋白质组学技术,筛查到277个蛋白的表达量在乙酸作用下发生了显著变化。在10、20、30 m M乙酸处理的YUAN-3样品中分别鉴定到78、121、216个差异表达蛋白。生物信息学分析表明,乙酸胁迫对菌株YUAN-3中的碱性蛋白、低分子量蛋白以及定位于细胞质中的蛋白影响更大。乙酸抑制了菌株YUAN-3中生长相关蛋白、碳源及磷元素吸收相关蛋白的表达,这是造成YUAN-3产气速率降低,发酵时间延长的主要原因。二氢嘧啶酶、二氢嘧啶脱氢酶与β-丙氨酸合酶等参与β-丙氨酸和嘧啶代谢途径的蛋白,以及硫氧还蛋白与过氧化物酶等氧化应激蛋白在菌株YUAN-3应对乙酸导致的细胞酸化中发挥重要的生理功能。为了探明E.harbinense代谢产物谱的改变机制,首先,通过考察乙醇累积下菌株YUAN-3产氢特性的变化,明确乙醇累积是导致菌株YUAN-3发生代谢产物谱改变的原因。在50、100、200 m M的外加乙醇作用下,菌株YUAN-3自身所生成的乙醇产量分别增加了15.1%、30.1%与27.4%。随着乙醇浓度增加(0-200 m M),H2与乙酸产量大幅度减少。H2产量从1888.6±45.8 m L·L-1下降到837±64.7 m L·L-1,乙酸产量从1767.7±45 mg·L-1下降到160.6±44.7 mg·L-1,而CO2产量未发生显著变化。其次,利用定量蛋白质组学技术发现263个蛋白质的表达量在乙醇累积下发生了显著变化。50、100、200 m M乙醇处理的菌株YUAN-3样品中分别鉴定到48、153、147个差异表达蛋白。生物信息学分析发现乙醇累积对菌株YUAN-3中的酸性蛋白、高分子量蛋白以及定位于细胞质中的蛋白表达影响更大。双功能乙醛-Co A/乙醇脱氢酶(ADHE)在外加乙醇作用下表达量升高是导致菌株YUAN-3自身所生成的乙醇产量增加,H2与乙酸产量大幅度减少的主要原因。同时,乙醇累积显著影响了菌株YUAN-3中参与糖酵解的蛋白以及参与调控碳代谢与氮代谢的关键蛋白的表达,这也是造成菌株YUAN-3各个末端代谢产物的产量发生变化的原因。此外,脱硫铁氧还蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶及组氨酸生物合成途径相关蛋白在菌株YUAN-3应对乙醇胁迫反应中发挥重要功能。对L-半胱氨酸提高菌株YUAN-3代谢活性的机制进行了解析,在发酵产氢特性方面,发现在0-2 m M范围内,培养基中L-半胱氨酸浓度的增加可以显著提高菌株YUAN-3的产氢速率、代谢产物产量以及生物量。同时,通过定量蛋白质组与乙酰化修饰蛋白组分析结果表明,L-半胱氨酸主要通过以下方式调控菌株YUAN-3的代谢活性:第一,培养基中L-半胱氨酸的浓度变化对菌株YUAN-3中L-半胱氨酸与L-甲硫氨酸代谢途径的蛋白表达产生了显著影响,推测在0-2 m M范围内增加L-半胱氨酸浓度可以减少菌株YUAN-3中L-同型半胱氨酸的积累,从而提高其代谢活性。第二,L-半胱氨酸通过影响参与能量代谢、细胞生长、细胞内酶活性调节等过程的蛋白乙酰化修饰来进一步调控菌株YUAN-3的代谢活性。第三,PYG培养基中添加L-半胱氨酸可以明显降低菌株YUAN-3的整体蛋白质乙酰化修饰水平,从而减少乙酰辅酶A的消耗,这也是L-半胱氨酸提高菌株代谢活性的原因。第四,菌株YUAN-3糖酵解及产氢产乙醇代谢途径中的蛋白受乙酰化修饰的密切调控。另外,该研究中鉴定到28%的E.harbinense基因组注释蛋白具有乙酰化修饰,证实了蛋白乙酰化修饰在E.harbinense中大量存在并具有重要的代谢调控作用。