背景：肾脏的发育是一个复杂过程，需要输尿管芽（UB）和后肾间充质（MM）两种细胞群精确的相互作用来完成的。某一环节出现错误会导致肾脏发育不良、膀胱输尿管反流等严重的肾脏和尿道发育异常。Robo2通过其配体Slit2在肾脏发育过程中发挥重要作用。Robo2/Slit2基因缺失可以导致调节肾脏发育的主要因素Gdnf的表达异常，从而使肾脏和输尿管发育异常，引起多个肾脏、多个输尿管和输尿管扩张改变。但是目前对于Robo2调控肾脏和输尿管发育的研究仍比较缺少，主要是对肾脏发育初期Robo2/Slit2基因敲除导致输尿管芽萌出异常的研究，缺乏Robo2对肾脏发育后期的影响以及Robo2基因缺失导致肾脏和输尿管发育异常的机制研究。目的：通过观察和分析Robo2在肾脏发育过程中的表达变化、体外过表达Robo2对肾脏发育的影响、Robo2基因敲除对小鼠肾脏和输尿管发育的影响等现象，揭示Robo2在肾脏和输尿管发育过程中的作用及其机制。方法：(1)显微分离胚龄E12.5d、E13.5d、E14.5d、E15.5d、E16.5d、E17.5d、E18.5d胎鼠肾脏和生后日龄P1d、P1w、P4w小鼠肾脏，石蜡切片进行PAS染色系统观察小鼠肾脏发育各阶段的形态学变化特点；应用实时定量RT-PCR技术对肾脏组织中Robo2mRNA水平表达进行半相对定量分析；应用免疫荧光技术检测小鼠肾脏发育过程中Robo2蛋白水平的表达部位。(2)显微分离胚龄E12.5d小鼠胚胎肾组织，应用显微注射及电转染方法，进行表达载体显微注射、转染。实验分为三组，正常对照组、空载体组、转染GFP-Robo2组。将体外转染的胚肾置于Transwell膜上，以气液交界面的方式培养3天后，进行肾小球和输尿管芽标志物（WT1、E-cadherin）和细胞增殖和凋亡（PH3、TUNEL）免疫荧光染色，观察输尿管芽分支、肾小球数目及后肾间充质细胞增殖、凋亡变化情况。(3)取野生型胚龄E13.5d和E14.5d小鼠胚胎输尿管膀胱组织，应用免疫荧光染色和实时定量RT-PCR的方法检测Robo2在输尿管、膀胱和中肾管（WD）的表达情况；应用组织PAS染色和免疫荧光染色的方法，观察Robo2基因敲除小鼠胚胎肾脏和输尿管发育异常的情况。(4)取野生型胚龄E12.5d小鼠胚胎肾脏、输尿管和膀胱组织，分别进行分离培养，分为正常培养组、去肾组、去膀胱组和去肾去膀胱组，共4组，每组10个，于Transwell气液交界面上培养6天后，进行E-cadherin和α-SMA免疫荧光染色，观察各组输尿管长度的变化情况；并且应用显微注射和电转染的方法，对野生型E12.5d胚胎的膀胱三角区进行GFP-RNAiRobo2质粒转染，体外培养6天后进行E-cadherin和α-SMA免疫荧光染色，观察输尿管长度的变化情况。(5)取同窝E13.5d Robo2基因敲除野生型和纯合子胚胎，冰冻包埋连续切片，TUNEL染色观察CND（common nephric duct)凋亡情况。结果：(1)肾脏发育过程中不同时间点的形态特征：①小鼠肾脏发育各阶段PAS染色结果显示，UB于E11.5d开始分支，E15.5d可见到初步形成的肾盂、肾盏；E16.5d有发育成熟的集合管、肾盂、肾盏；②M M在整个后肾发育阶段围绕UB呈“帽”状分布；E13.5d UB周围的MM聚集成团，可见逗号形体、S形体；E14.5d出现肾小囊腔；E15.5d出现发育成熟的肾小球；E16.5d可见发育成熟的肾单位（肾小球、近端小管、远端小管等）；出生后1.5d至1w肾小球数目继续增多；出生后2w肾脏发育成熟。(2)肾脏发育过程中Robo2的表达变化：①实时定量RT-PCR结果显示，Robo2在发育的E12.5d～E14.5d表达水平最高，随后水平明显下降，在出生后维持在低水平表达。②免疫荧光染色结果显示,Robo2最初表达在胚肾的后肾间充质，而不在输尿管芽表达。随着胚胎肾脏发育，Robo2表达于后肾间充质细胞膜、围绕输尿管芽的浓缩帽状间充质、逗号形体和“S”形体以及毛细血管袢，最终表达于肾小球足细胞。另外，部分早期肾小管上皮细胞也有微弱Robo2表达。(3)过表达Robo2对肾脏发育的影响：①输尿管芽标志物E-cadherin和肾小球标志物WT1免疫荧光染色显示，正常对照组、转染空载体组肾脏输尿管芽分枝和肾小球数目无明显异常；而转染GFP-Robo2组的输尿管芽分枝减少，肾小球数目减少（p <0.05）。②与对照组相比，过表达Robo2组出现后肾间充质减少，输尿管芽顶端缺少聚集的帽状间充质。③与正常对照组和转染空载体组比较，过表达Robo2组肾脏后肾间充质细胞凋亡情况未见明显异常（p＞0.05），并且E-cadherin染色显示输尿管芽上皮细胞形态及排列无异常。(4) Robo2基因敲除对小鼠肾脏和输尿管发育的影响：①免疫荧光染色显示Robo2表达在膀胱三角区的疏松结缔组织、CND和输尿管；实时定量RT-PCR显示，Robo2在输尿管、膀胱、脑、肺组织中均有不同程度的表达，在膀胱和输尿管的含量多于肺组织但少于脑组织的含量。②与同窝野生型小鼠比较，Robo2基因敲除小鼠表现为肾脏明显变小，有多个肾脏、多个输尿管，输尿管缩短，输尿管积水和输尿管与膀胱连接异常。(5)输尿管发育的影响因素及Robo2影响输尿管发育的可能机制：①野生型E12.5d小鼠胚胎肾脏、输尿管和膀胱组织体外培养发现，与正常培养组相比，去肾组输尿管长度延长无明显差异（p＞0.05），去膀胱组和去肾去膀胱组输尿管长度延长明显变短（p<0.05）。②在膀胱三角区转染GFP-RNAiRobo2质粒后，与正常培养组相比，输尿管长度延长无明显异常（p＞0.05）。③R obo2基因敲除纯合子小鼠膀胱三角区的CND末端可见到凋亡，但异常部位的CND无凋亡。结论：Robo2在肾脏和输尿管中发育过程中均有表达，对肾脏和输尿管的发育有重要作用；Robo2体外过表达可以导致肾脏输尿管芽减少，后肾间充质聚集减少等异常；体内Robo2基因敲除可以引起输尿管的发育异常，主要是由于异常部位的输尿管未能与膀胱正确连接所致。