水稻细胞质雄性不育及其恢复性是水稻杂种优势利用的遗传基础。基于水稻CMS的杂交育种已取得很大成功，但其不育机理的研究一直落后于生产应用。分离水稻细胞质雄性不育基因及其核恢复基因，研究它们相互作用方式，对阐明细胞质雄性不育及育性恢复机理具有重要的理论意义和应用价值。BT型细胞质雄性不育是水稻中发现的多种雄性不育类型之一。本实验室通过遗传定位和同源比较方法筛选了2个BT型不育恢复候选基因。本论文通过遗传转化方法，对水稻BT型细胞质雄性不育和恢复候选基因的功能进行了鉴定和分析，主要结果如下： 1.将候选基因ORF＃1和ORF＃3构建成植物转化载体，利用农杆菌介导的遗传转化法，导入水稻BT型细胞质雄性不育系，分别获得到21个和8个独立转化体。花粉育性鉴定表明，大部分T0代转化体的花粉育性得到部分恢复，一些转化体能自交结实，最高结实率达到70％，证明ORF＃1和ORF＃3都是BT型细胞质雄性不育恢复基因。因此将ORF＃3命名为Rfla，ORF＃1命名为Rf1b。 2.构建用强启动子驱动Rf1b的超表达载体转化BT型不育系，共得到18个抗性愈伤,73株转化苗。Northern杂交证实Rf1b获得强表达。花粉染色鉴定表明，部分转化体的花粉染色较深，但小穗不结实，说明其育性恢复的程度较低。 3.将BT型细胞质雄性不育候选基因orf79构建成有线粒体定位信号的P35S启动子驱动的表达载体，转化正常可育粳稻品种。花粉染色鉴定表明，部分T0代转化体的花粉表现为典型的半不育现象。对半不育的转化体(单位点T-DNA插入)的T1代株系进行Northern杂交分析发现，有转基因和没有转基因的植株的分离比符合1∶1，符合配子体不育类型的分离规律，说明orf79即是水稻BT型细胞质雄性不育基因。 4.进一步构建了有线粒体定位信号和没有线粒体定位信号的orf79-GFP融合基因表达载体，转化正常可育粳稻品种。花粉育性观察表明，2种载体的转化体都有典型的花粉半不育现象。转基因分离分析发现，2种载体的转化体都有一些T1株系(单位点T-DNA插入)呈现1∶1的分离。说明ORF79蛋白不进入线粒体也有雄性配子体不育效应。 5.将上述(3)的载体转化拟南芥，各获得若干个转化体。观察了部分转化体的花粉育性，有1个转化体(有线粒体定位信号)的花粉表现为半不育。其余的转化株的育性检测及其后代的分离分析正在进行中。 6.以orf79(有部分atp6片段)为探针对Rf1a和Rl1b转化体进行Northern杂交检测，发现Rf1a使B-atp6/orf79mRNA(2.0kb)发生剪切，产生新的1.4kb、1.0kb、和0.45kb的片段；Rf1b使B-atp6/orf79mRNA发生降解。当Rf1a和Rl1b共同存在时，B-atp6/orf79的加工模式与Rf1a单独存在时一致，即只发生Rf1a对B-atp6/orf79的剪切加工，不发生降解作用，说明相对于RFlB,RFlA对B-atp6/orf79mRNA的作用具有上位性效应。 以上结果表明，BT型不育系线粒体基因组表达的B-atp6/orf79双顺反子mRNA产生的ORF79蛋白是导致雄性配子体不育的原因。而恢复系的恢复基因座Rf-1含有2个编码PPR蛋白的恢复基因。本研究鉴定的恢复基因Rf1a和Rf1b的表达产物分别通过介导位点特异切断和完全降解的不同机制破坏B-atp6/orf79mRNA，使之不能产生ORF79蛋白，从而恢复花粉的正常发育。