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目的本实验室前期研究发现乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR细胞株中存在一种新的CD44变异体(CD44v16),可以明显增强乳腺癌的干性,并促进乳腺癌细胞对阿霉素的耐药。本研究旨在进一步探索CD44v16对乳腺癌细胞的增殖、侵袭及转移的影响及其机制研究,为乳腺癌的复发和转移的诊断和治疗提供理论依据。方法1.根据CD44v16的基因序列设计并合成质粒,通过慢病毒将其转染至乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB-231中以获得稳定过表达细胞系,细胞可分为以下几组:CD44v16过表达组,阴性对照(NC)组及空白对照(N)组。并通过荧光定量PCR技术以进一步验证过表达CD44v16及阴性对照组慢病毒颗粒转染成功后CD44v16的mRNA相对表达量。2.通过CCK8法及流式细胞仪技术检测过表达CD44v16后MCF-7细胞及MDA-MB-231细胞增殖及凋亡的改变。3.通过细胞划痕法及Transwell侵袭试验检测CD44v16过表达后对MCF-7细胞及MDA-MB-231细胞迁移及侵袭能力的影响并进行相关机制研究。4.利用qRT-PCR及Western blot法检测各组细胞内侵袭相关基质金属蛋白酶的mRNA及蛋白质表达水平。并进一步了解CD44v16所诱导的通路激活情况,检测MAPK通路相关蛋白总蛋白及磷酸化蛋白表达。5.通过Western blot法验证各组细胞在JNK及ERK1/2通路抑制剂处理后相关通路蛋白表达情况,以及对基质金属蛋白酶7表达影响。并进一步通过细胞划痕法及Transwell侵袭试验通路验证抑制剂处理后对细胞迁移及侵袭能力的影响。结果1.成功将慢病毒颗粒转染至MCF-7细胞及MDA-MB-231细胞内并用嘌呤霉素进行筛选,于荧光显微镜内观察GFP表达率至90%以上。MCF-7/CD44v16过表达组细胞中CD44v16的mRNA相对表达量明显高于NC组及N组细胞(P<0.001);在MDA-MB-231/CD44v16过表达组细胞中CD44v16的mRNA相对表达量明显高于较NC组及N组细胞(P<0.01)。2.在细胞培养24h后MCF-7/CD44v16及MDA-MB-231/CD44v16过表达组细胞的增殖率,较NC组及N组细胞均明显增强(P<0.01);流式细胞仪技术检测MCF-7/CD44v16及MDA-MB-231/CD44v16组细胞的凋亡率,较NC组及N组细胞明显降低(P<0.001)。3.细胞划痕处理后予无血清培养基培养48h后MCF-7/CD44v16及MDA-MB-231/CD44v16过表达组细胞,细胞迁移能力较NC组及N组细胞明显增高(P<0.001);Transwell试验结果表明,过表达CD44v16后细胞的侵袭能力均明显增高(P<0.001)。4.利用qRT-PCR技术及Western blot法结果表明MCF-7/CD44v16过表达细胞中细胞MMP7的mRNA及蛋白表达量较NC组及N组细胞明显增高(P<0.001),MMP2及MMP9在各组间表达无统计学差异;而且通过Western blot法结果表明在MCF-7/CD44v16过表达细胞的磷酸化JNK蛋白及磷酸化ERK1/2蛋白表达量明显增高(P<0.001),JNK及ERK1/2双重信号转导通路被明显激活,而P38的表达量显示CD44v16的表达对改信号转导通路无影响。5.将各组细胞在JNK抑制剂(SP600125)及ERK1/2抑制剂(U0126)预处理24h后,发现MCF-7/CD44v16中抑制剂处理细胞组较未处理细胞组成功抑制CD44v16诱导基质金属蛋白酶7过表达(P<0.001),并抑制其所有的细胞迁移及侵袭能力。结论1.在乳腺癌MDA-MB-231细胞及MCF-7细胞中过表达CD44v16,结果表明CD44v16过表达可以促进细胞增殖及抑制细胞凋亡的同时,明显增强细胞的迁移及侵袭能力。2.CD44v16在MCF-7细胞中可以通过JNK及ERK1/2双重信号转导通路的作用促进MMP7的过表达,利用通路抑制剂处理后将明显抑制CD44v16诱导的MMP7的过表达并降低其所诱导的迁移及侵袭能力。