目的:探讨ER-α36不同表达水平对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞株miRNAs表达谱的影响以及阿霉素耐药的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞株miRNAs表达谱的变化。通过筛选出差异表达的miRNAs并分析其调控的靶基因与信号通路,为进一步揭示乳腺癌细胞ER-α36表达对三阴性乳腺癌生物学行为影响可能的分子调控机制及阿霉素耐药机制提供更多的实验依据,同时也为高表达ER-α36乳腺癌患者的分子诊断、临床分型、预后判断、耐药监测等提供新的候选检测指标和临床检测新途径。方法:1.采用慢病毒转染法将负载ER-α36特异性短发夹RNA的重组慢病毒转染至三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231,通过嘌呤霉素筛选,以构建ER-α36基因沉默的稳定转染细胞株,并采用该细胞株建立裸鼠移植瘤模型。同时采用阿霉素耐药的三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231/ADR建立相应裸鼠移植瘤模型。2.分别采用qRT-PCR法和Western blot法检测ER-α36沉默后及阿霉素耐药的MDA-MB-231细胞株和移植瘤的ER-α36 m RNA及ER-α36蛋白的表达变化。3.分别设置慢病毒感染ER-α36沉默组(沉默实验组)、慢病毒感染ER-α36未沉默组(阴性对照组)、未感染空白对照组(空白对照组)、阿霉素耐药组及未耐药组。采用高通量测序技术分析各组细胞的miRNAs表达谱变化,按照FC>1.5,P<0.05且组内CPM均值≥1的筛选标准,筛选出各组细胞间具有显著差异的miRNAs作为候选检测指标。4.采用qRT-PCR法验证细胞株、移植瘤体细胞、临床乳腺癌病理组织及患者血清样本中候选miRNAs指标的表达水平。5.采用miRDB、Target Scan数据库对相关差异表达miRNAs进行功能预测。结果:1.成功构建ER-α36基因沉默细胞株及裸鼠移植瘤动物模型。沉默实验组与阴性对照组及空白对照组相比,ER-α36 m RNA及其蛋白表达均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2.成功获得阿霉素耐药细胞株及裸鼠移植瘤动物模型;耐药组与未耐药组相比,耐药组细胞可在含2μg/ml阿霉素培养液中稳定生长,对阿霉素敏感性降低,细胞增殖活性增高,差异有统计学意义(P<0.05)。3.对沉默实验组、阴性对照组及空白对照组细胞的miRNAs高通量测序分析,结果显示沉默实验组与空白对照组相比有45个miRNAs上调、28个下调;与阴性对照组相比有32个miRNAs上调、24个下调。剔除无关序列sh RNA慢病毒载体可能引起的差异表达miRNAs,并结合相关文献报道,最终选取6个显著性差异表达的miRNAs作为候选指标。将候选指标在不同细胞株及移植瘤细胞中进行qRT-PCR验证,结果显示沉默实验组细胞株和移植瘤细胞中hsa-miR-200a-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-181a-5p均为表达上调,hsa-miR-3940-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-197-3p均为表达下调,与阴性对照组和空白对照组比较差异有统计学意义(均P<0.05),且与高通量测序结果一致。4.将上述筛选出的6个miRNAs候选指标进行临床乳腺癌病理组织及患者血清样本的qRT-PCR验证。结果显示:与癌旁组织相比,乳腺癌组织hsa-miR-200a-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-181a-5p表达均呈不同程度降低,hsa-miR-3940-3p、hsa-miR-15b-5p表达均呈不同程度升高;进一步分析ER(+)和ER(-)乳腺癌组织,发现hsa-miR-200a-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-181a-5p在ER(-)乳腺癌组织中表达明显低于ER(+)乳腺癌组织;hsa-miR-3940-3p、hsa-miR-15b-5p在ER(-)乳腺癌组织中表达明显高于ER(+)乳腺癌组织,差异有统计学意义(均P<0.05)。乳腺癌患者血清中hsa-miR-200a-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-181a-5p及hsa-miR-3940-3p的表达情况与乳腺癌组织中的表达结果一致,与健康人血清比较差异有统计学意义(均P<0.05)。5.对阿霉素耐药组及未耐药组细胞的miRNAs高通量测序分析,结果显示耐药组与未耐药组相比有197个miRNAs上调、200个下调。选取其中6个显著性差异表达的miRNAs作为候选指标,在耐药细胞株及相应移植瘤细胞中进行qRT-PCR验证,结果显示耐药组hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-155-5p均为表达上调,hsa-miR-584-5p、hsa-miR-34c-3p、hsa-miR-27b-3p均为表达下调,与未耐药组比较差异有统计学意义(均P<0.05),且与高通量测序结果一致。6.对差异表达的相关miRNAs进行功能预测分析。沉默实验组与空白对照组相比,GO分析结果显示差异表达的miRNAs主要参与了细胞代谢、细胞定位过程;KEGG分析结果显示,表达上调的miRNAs主要与Fox O、c AMP信号通路相关,表达下调的miRNAs主要与Hippo信号通路相关。耐药组与未耐药组相比,GO分析结果显示表达差异的miRNAs主要参与细胞代谢、蛋白质定位过程;KEGG分析结果显示,表达上调的miRNAs主要与Rap1、Hippo信号通路相关,表达下调的miRNAs主要与p53、Ras信号通路相关。单个miRNA与多个靶基因有匹配结合位点,多个miRNAs之间有共同的靶基因。结论:1.ER-α36不同表达水平对三阴性乳腺癌细胞miRNAs表达谱的改变有明显影响。筛选出的6个显著差异表达的miRNAs,反映了高表达ER-α36的三阴性乳腺癌特征性miRNAs表达谱,可以用作乳腺癌诊断、分型鉴定的参考标志物,也为临床药物选择及预后判断提供了新的监测指标。同时提示差异表达的miRNAs可能参与了三阴性乳腺癌中ER-α36介导的信号通路的调控。2.阿霉素耐药亦对三阴性乳腺癌细胞miRNAs表达谱的改变有明显影响。筛选出的6个显著差异表达的miRNAs,反映了阿霉素耐药的三阴性乳腺癌特征性miRNAs表达谱,为耐药监测提供潜在标志物,也为miRNA在三阴性乳腺癌耐药机制的深入研究奠定基础。3.循环血清miRNAs与乳腺癌细胞存在较好的一致性,提示筛选出的4个差异表达miRNAs可作为临床鉴别ER-α36不同表达水平乳腺癌的检测指标。同时也为临床提供了一种非创伤性和更为简捷的检测手段。4.miRNA参与了三阴性乳腺癌发生发展的相关信号通路,可为进一步研究三阴性乳腺癌的发病机制及耐药机制提供新的实验依据。