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目的建立锁核酸修饰的等位基因特异性实时荧光定量PCR(即RT-AS-LNA-q PCR)检测HBV阿德福韦酯耐药突变,并对该方法进行临床应用评价。方法1建立RT-AS-LNA-q PCR检测HBV阿德福韦酯耐药突变1.1 RT-AS-LNA-q PCR方法学的建立包括反应体系、扩增条件、制备质粒标准品、制备标准曲线等。1.2 RT-AS-LNA-qPCR方法学的评价用RT-AS-LNA-q PCR检测重组野生型、突变型质粒标准品(1×1010 copies/μl~1×101 copies/μl),评价其线性范围、特异性、灵敏度、重复性、准确性及检测突变型HBV DNA的灵敏度等。1.3方法学比较Sanger测序法与自建方法平行检测临床标本,通过Kappa一致性检验等分析比较两者的性能;用克隆测序法检测已用自建方法测出的含低水平突变DNA的临床样本,验证自建方法的准确性。1.4 RT-AS-LNA-q PCR临床应用评价用自建方法检测含有不同突变比例的临床混合模板,确定其能准确、稳定检测出的最低突变比例,评价其用于检测临床样本的灵敏度;结果1建立RT-AS-LNA-q PCR检测HBV阿德福韦酯耐药突变1.1 RT-AS-LNA-q PCR方法的成功建立成功制备了阿德福韦酯rt A181V位点、rt N236T位点质粒标准品以及标准曲线;确定了反应体系及扩增条件。1.2 RT-AS-LNA-q PCR方法学评价RT-AS-LNA-q PCR检测阿德福韦酯rt A181V位点、rt N236T位点野生型、突变型质粒标准品的线性范围均为1×109 copies/μl~1×102 copies/μl;rt A181V位点批内和批间变异系数(CV)在1.61%~12.8%之间;rt N236T位点批内和批间变异系数(CV)在3.22%~13.85%之间;RT-AS-LNA-q PCR在1×107 copies/μl野生背景下检测rt A181V位点、rt N236T位点突变的灵敏度均为10-5。1.3方法学比较RT-AS-LNA-qPCR和Sanger法检测rtA181V位点耐药情况,完全一致结果占88.2%(90/102),部分一致结果占11.8%(12/102),无完全不一致结果(0/102),两法一致性好(P=0.000);RT-AS-LNA-q PCR和Sanger法检测rt N236T位点耐药情况,完全一致结果占91.2%(93/102),部分一致结果占8.8%(9/102),无完全不一致结果(0/102),两法一致性好(P=0.000)。RT-AS-LNA-q PCR结果与克隆测序结果完全一致。1.4 RT-AS-LNA-q PCR临床应用评价自建方法用于检测临床标本的灵敏度为0.04%(rt A181V位点)、0.05%(rt N236T位点);RT-AS-LNA-q PCR突变检测灵敏度高,可应用于ADV早期耐药突变的检测。结论成功建立了RT-AS-LNA-q PCR方法用于检测HBV rt A181V和rt N236T耐药突变。该方法线性范围广、特异性好、灵敏度高、重复性佳,优于Sanger测序法,适合在一般基因诊断实验室推广应用。