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目的:三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）是一种特殊类型的乳腺癌,具有侵袭性强、易转移和预后不良的特点。TNBC不表达雌激素受体（Estrogen receptor,ER）、孕激素受体（Progesterone receptor,PR）和人表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor 2,HER2）,因此对内分泌治疗和HER2分子靶向治疗不敏感。目前,TNBC的治疗方式主要为手术和化疗,但总体预后较差,因此,需要新的治疗方案来提高TNBC的临床疗效。免疫治疗可能是一种有意义的治疗TNBC的方法。美国已经批准了抗PD-L1抑制剂Atezolizumab或抗PD-1抑制剂Pembrolizumab与化疗药物联合,用于治疗转移性PD-L1阳性的TNBC患者。肿瘤微环境中浸润的免疫细胞对TNBC的进展和转移至关重要。研究显示,肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor infiltrating lymphocytes,TILs）与TNBC的远处复发和总生存期显著相关。此外,肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）和骨髓源性抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）可通过分泌效应蛋白或调节T细胞功能影响TNBC生长。2型固有淋巴细胞（Group 2 innate lymphoid cells,ILC2s）属于固有免疫细胞,主要分布在肺、皮肤和肠粘膜组织。ILC2s经其经典活化因子IL-33、IL-25、胸腺基质淋巴生成素（Thymic stromal lymphopoetin,TSLP）等激活后,可分泌大量的包括IL-13、IL-5和IL-4在内的多种Th2型细胞因子,进而介导Th2型应答相关疾病的发生发展。近年来研究发现ILC2s在多种肿瘤中亦发挥关键作用。有文献报道,在小鼠恶性黑色素瘤、皮下淋巴瘤以及肺癌中,ILC2s具有正向的积极作用,可以抑制肿瘤的进展和转移;而在前列腺癌、膀胱癌和急性早幼粒细胞白血病中,ILC2s则发挥了促进肿瘤进展的负向作用。ILC2s在肿瘤中的作用似乎取决于特定的肿瘤微环境。在不同的肿瘤微环境中,ILC2s通过产生不同的细胞因子、聚集不同类型的免疫细胞及表达不同的免疫相关分子,由此表现出不同的抗肿瘤或促肿瘤的作用。研究发现ILC2s在人乳腺恶性组织中的数量高于良性组织。此外,ILC2s的经典活化因子IL-33促进小鼠4T1肿瘤生长和远处转移的同时,能显著增加荷瘤鼠肿瘤组织内分泌IL-5和IL-13的ILC2s数量,提示活化的ILC2s可能参与乳腺癌的进展。然而,在三阴性乳腺癌远端转移,尤其是极易发生且治疗困难、死亡率极高的肺转移中,ILC2s的具体作用及潜在作用机制尚不清楚。故本研究利用小鼠TNBC肺转移模型,探讨ILC2s在TNBC肺转移中的作用,以期望能为阐明肿瘤发生发展机制及临床免疫学治疗提供实验佐证。研究方法:1.6-8周龄的BALB/c雌鼠经尾静脉接种2×10~5个4T1细胞,建立小鼠TNBC肺转移模型。小鼠4T1荷瘤后第0、7、14天,利用流式细胞术检测肺组织内ILC2s及分泌IL-13或IL-5的ILC2s数量;利用免疫磁珠分选荷瘤鼠肺ILC2s,qRT-PCR检测肺ILC2s的IL-13及IL-5 mRNA表达水平。2.利用免疫磁珠分选正常BALB/c鼠肺组织ILC2s。将2×10~4个ILC2s于4T1荷瘤前2h经尾静脉回输至BALB/c鼠。荷瘤后第14天,利用HE染色和Ki67免疫组化染色比较ILC2s回输组和未回输组模型鼠肺内的转移结节数量、转移面积和Ki67阳性肿瘤细胞比例的变化,同时观测生存率的变化。3.利用qRT-PCR和ELISA检测ILC2s回输组和未回输组模型鼠肺组织IL-13和IL-5的mRNA及蛋白水平;利用抗IL-13单克隆抗体体内中和IL-13活性,HE染色和Ki67免疫组化染色比较IL-13阻断组与对照组之间肺内转移结节数量、转移面积和Ki67阳性肿瘤细胞比例的变化,同时观测生存率的变化。4.利用qRT-PCR和Western blot检测ILC2s回输组和未回输组模型鼠肺MDSCs的IL-13Ra1 mRNA及蛋白水平;利用流式细胞术检测各组模型鼠肺组织内MDSCs的百分比和绝对数量,利用qRT-PCR检测各组模型鼠肺MDSCs的Arg1、iNOS、TGF-β、IL-10 mRNA表达水平。5.4T1荷瘤后第14天,利用免疫磁珠分选荷瘤鼠肺中的ILC2s和MDSCs,将二者体外Transwell共培养,并加入抗IL-13单克隆抗体。qRT-PCR检测MDSCs中Arg1、iNOS、TGF-β、IL-10 mRNA水平,ELISA法检测MDSCs培养上清中Arg1、iNOS、TGF-β、IL-10的蛋白水平。6.利用抗Gr-1单克隆抗体体内去除MDSCs。荷瘤后第14天,利用HE染色和Ki67免疫组化染色比较实验组与对照组肺转移结节数量、肺转移灶面积和ki67阳性肿瘤细胞比例的变化,同时观测生存率的变化;利用流式细胞术检测模型鼠肺组织CD4+T细胞、CD8+T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞、IFN-γ+CD8+T细胞和Tregs的细胞数量。7.小鼠4T1荷瘤后第0、7、14天,qRT-PCR检测肺组织内IL-33、IL-25和TSLP mRNA表达水平。利用抗TSLP单克隆抗体体内阻断TSLP。荷瘤后第14天,利用流式细胞术检测阻断TSLP后,肺组织内ILC2s的比例和绝对数量的变化;利用免疫磁珠分选荷瘤鼠肺ILC2s,qRT-PCR检测其IL-13及IL-5 mRNA表达水平。结果:1.TNBC模型鼠肺组织中ILC2s总数及分泌IL-13的ILC2s数量显著增加:与正常对照组相比,4T1荷瘤小鼠肺组织内ILC2s及分泌IL-13的ILC2s的百分比和绝对数量均显著增加,其中以荷瘤后第14天增加最为明显,而分泌IL-5的ILC2s数量没有明显变化;与正常对照组相比,在4T1荷瘤后的第14天肺ILC2s的IL-13和IL-5 mRNA表达水平均显著升高。结果提示肺ILC2s可能与TNBC肺转移过程有关。2.过继回输ILC2s促进TNBC肺转移:与对照组相比,ILC2s回输鼠肺组织内ILC2s数量明显增多,说明过继回输实验的成功。与未回输组相比,回输ILC2s的4T1荷瘤鼠,其肺内转移结节数量、转移灶面积百分比和Ki67阳性肿瘤细胞比例均明显增加,而存活率下降。结果说明肺ILC2s促进TNBC肺转移的发生发展。3.ILC2s通过分泌IL-13促进TNBC肺转移:与未回输组相比,回输ILC2s的4T1荷瘤鼠,其肺组织内IL-13的mRNA及蛋白水平均增高,但IL-5水平无明显变化;阻断IL-13明显抑制回输ILC2s对小鼠TNBC肺转移的促进作用,因回输ILC2s而增多的肺内转移结节数量、转移灶面积百分比和Ki67阳性肿瘤细胞比例,在阻断IL-13后均显著下降,而荷瘤鼠生存率有所提高。结果提示ILC2s促4T1肺转移作用依赖于IL-13。4.ILC2s来源的IL-13激活肺MDSCs的功能:与未回输组相比,回输ILC2s的4T1荷瘤鼠肺组织内MDSCs的百分比和绝对数量明显增多,且其IL-13受体IL-13Ra1 mRNA及蛋白水平亦显著升高。肺MDSCs的Arg1、iNOS、TGF-β和IL-10mRNA表达水平亦因回输ILC2s而显著升高。阻断IL-13可显著降低ILC2s激活肺MDSCs的能力,因回输ILC2s而增高的肺MDSCs数量及其Arg1、iNOS、TGF-β和IL-10表达水平,在阻断IL-13后,均显著下降。结果表明在4T1肺转移小鼠模型中,ILC2s通过IL-13激活了肺MDSCs。5.体外实验验证ILC2s产生的IL-13对MDSCs增殖和活化的影响:相较于MDSCs单独培养组,与肺ILC2s体外共培养的MDSCs,其数量及其Arg1、iNOS、TGF-β、IL-10 mRNA表达水平均显著增加,培养上清中Arg1、iNOS、TGF-β和IL-10蛋白水平亦明显升高。结果表明ILC2s可刺激肺MDSCs的增殖和活化。然而,在共培养体系加入抗IL-13抗单克隆抗体,则显著降低MDSCs的数量及其Arg1、iNOS、TGF-β、IL-10表达水平。体外实验进一步验证了ILC2s通过产生的IL-13促进了4T1肺转移小鼠肺内MDSCs的增殖和活化。6.ILC2s调控的MDSCs通过抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞及诱导Treg细胞促进TNBC肺转移:回输ILC2s的荷瘤鼠体内给与抗Gr-1中和抗体去除MDSCs后,肺内转移结节数量、转移灶面积百分比和Ki67阳性肿瘤细胞比例均明显下降,而小鼠生存率得以提高。结果提示ILC2s诱导的4T1肺转移依赖于MDSCs。去除MDSCs亦显著提高荷瘤鼠肺组织内CD4+T细胞、CD8+T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞数量,减少Treg细胞数量。结果提示ILC2s调控的MDSCs通过抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞及诱导Treg细胞促进TNBC肺转移。7.TSLP上调荷瘤鼠肺ILC2s的数量和活性:小鼠荷瘤后第14天,肺组织内ILC2s的经典活化因子TSLP mRNA表达水平明显升高,而IL-33和IL-25则没有明显变化。结果提示TSLP可能是激活ILC2s的重要因子。体内使用抗TSLP单克隆抗体阻断TSLP后,荷瘤鼠肺组织内ILC2s的百分比和绝对数减少,其IL-13 mRNA表达水平亦明显下降。结果表明TSLP在4T1肺转移小鼠肺ILC2s的增殖和活化中发挥关键作用。结论:在小鼠TNBC肺转移中,肿瘤微环境内的TSLP促进肺ILC2s的活化,活化的ILC2s通过ILC2-IL-13-MDSC免疫调节通路促进了TNBC肺转移的进展。