【摘 要】
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布鲁菌病由布鲁菌引起,主要导致感染动物流产、不孕、关节炎等症状。它是世界上最严重的人畜共患传染病之一。其检测方法各有弊端。本试验针对新分离的菌株进行全基因组测序,用生物信息学软件对菌株基因的同源性和BvrS蛋白的抗原性进行预测分析,并利用此蛋白构建表达载体,以表达纯化后的蛋白作为抗原建立间接ELISA检测方法。目的在于建立一个高准确率的布鲁菌临床初筛检测方法。首先对布鲁菌淄博地方分离株进行全基因组
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布鲁菌病由布鲁菌引起,主要导致感染动物流产、不孕、关节炎等症状。它是世界上最严重的人畜共患传染病之一。其检测方法各有弊端。本试验针对新分离的菌株进行全基因组测序,用生物信息学软件对菌株基因的同源性和BvrS蛋白的抗原性进行预测分析,并利用此蛋白构建表达载体,以表达纯化后的蛋白作为抗原建立间接ELISA检测方法。目的在于建立一个高准确率的布鲁菌临床初筛检测方法。首先对布鲁菌淄博地方分离株进行全基因组高通量测序。利用16S RNA进行多序列比对分析确定该菌株为布鲁菌。将菌株全基因组与近缘菌株基因序列进行比对,并构建系统发育树,发现该菌株为马耳他布鲁菌。该菌株虽然与多株马耳他布鲁菌有极高的同源性,但全基因组与其他已知菌株基因组均不完全相同。其次,利用生物信息学软件对BvrS蛋白的理化性质、B细胞抗原表位、T细胞抗原表位、跨膜结构域等进行预测。共预测到23个抗原决定簇预测,13个B细胞线性抗原表位,多个T细胞抗原表位。结果发现BvrS蛋白具有较好的抗原性,可做为间接ELISA检测方法的抗原。使用TMNMM对于BvrS蛋白进行预测,发现该蛋白具有两次跨膜,跨膜域疏水性较高,对蛋白表达影响较大,故选择胞外域311-601aa进行基因扩增及p ET-28a（+）-BvrS表达载体的构建。构建好的表达载体表达蛋白的最终浓度为1.78 mg/m L。将制备的蛋白作为抗原,建立i ELISA检测方法,并对各参数进行了优化。优化结果表明,包被蛋白最佳浓度为1μg/m L,最佳血清稀释度为1:25,驴抗山羊Ig G-HRP最佳稀释度为1:2000,最佳封闭为5%BSA。使用新建立的i ELISA（BvrS）检测方法对山东省16个地市共计800份随机样品进行检测,并与其他检测方法进行比较,结果显示与虎红平板凝集试验阳性符合率为83.87%、与试管凝集试验阳性符合率为80.77%、与c ELISA阳性符合率为88.46%。建立的i ELISA（BvrS）检测方法准确性高,可用于大量样本的羊布鲁菌临床初筛。综上所述,经全基因组测序分析发现此菌株为马耳他布鲁菌,通过对其BvrS蛋白的生物信息学预测分析,发现此蛋白具有良好的抗原性。以表达纯化的BvrS蛋白作为包被抗原,构建了i ELISA（BvrS）布鲁菌病检测方法,准确率高,可用于羊布鲁菌的临床初筛。
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