防御素是富含半胱氨酸的阳离子肽,在消化系统,呼吸系统,免疫系统和生殖系统中均有分布,并在这些系统中起到抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用。防御素在无脊椎动物和脊椎动物的先天免疫系统中起着重要作用。本研究建立一种荧光定量PCR检测β-防御素7（AVBD7）的方法,通过使用此方法检测鸭AVBD7在健康鸭组织中的分布以及感染禽致病性大肠杆菌（APEC）和产气荚膜梭菌（CP）后鸭AVBD7的表达变化情况。成功构建鸭AVBD7原核表达载体并验证其在大肠杆菌中的表达,具体研究结果如下:（1）从健康鸭脾脏中提取RNA并反转录为c DNA,进行PCR扩增得到片段为152 bp的AVBD7基因片段。将测序成功的PCR产物与载体p MD18-T进行连接反应,并将连接成功的产物转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞。培养12 h后挑取单一的圆滑菌落进行菌液PCR鉴定并送测序,提取p MD18-T-AVBD7阳性标准品质粒。以阳性标准品质粒作为模板,进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测。以Ct值为y轴,以样品浓度为x轴,绘制实时荧光定量PCR标准曲线,y=-3.2773x+33.681,E=101.90%,R~2=0.9966。进行特异性检测、敏感性检测和重复性检测实验,结果显示:该检测方法特异性强,无引物二聚体及非特异性产物;灵敏度高,最低可检测到1.14copies/μL;重复性好,组内和组间Ct值变异系数均不超过1%,从而为检测鸭AVBD7在m RNA表达水平的定量分析提供了技术手段。（2）为了确定鸭AVBD7在鸭体内的分布情况,取健康樱桃谷肉鸭的大脑、小脑、气管、肺脏、心脏、肝脏、胸腺、肾脏、肌胃、脾脏、胰腺、十二指肠、法氏囊、空肠、腺胃、回肠、盲肠、直肠、肌肉、皮肤20种组织,提取总RNA来确定鸭AVBD7在各个组织的分布情况。使用建立的检测AVBD7的荧光定量方法检测AVBD7在健康鸭组织中的分布情况。结果显示:AVBD7 m RNA在大脑、肝脏中表达量较高,在空肠、直肠和盲肠中表达量较低。为了确认鸭AVBD7是否参与宿主抗细菌先天性免疫反应,使用建立的检测AVBD7 m RNA的荧光定量方法检测感染APEC和CP后鸭脑、脾脏和肝脏中AVBD7m RNA表达情况。结果显示:感染APEC后,在脑中,鸭AVBD7的表达水平在感染第1、3和5天均呈现上调趋势（P＜0.05）;在脾脏中,鸭AVBD7的表达在感染第3天下调,在感染第5天上调（P＜0.01）;在肝脏中,鸭AVBD7的表达在感染第1和3天表达水平下调,在感染第5天上调（P＜0.05）。感染CP后,在脑中,鸭AVBD7的表达水平在感染第1和3天均呈现上调趋势（P＜0.05）,在感染第5天下调;在脾脏中,鸭AVBD7的表达在感染第1和3天与对照组差异不大,在感染第5天上调（P＜0.01）;在肝脏中,鸭AVBD7的表达在感染第3和5天表达水平上调（P＜0.01）。（3）为了验证鸭AVBD7基因在大肠杆菌中的原核表达,通过PCR扩增反应扩增目的片段,对PCR产物进行琼脂电泳并将目的片段胶回收,将回收产物连接p ET32a（+）载体后进行测序验证。对原核表达载体p ET32a（+）-His进行双酶切,将目的片段与线性化载体同源重组,并将同源重组产物转化入DH5α感受态细胞,培养12 h后挑取单一的圆滑菌落进行菌液PCR鉴定并送测序。提取p ET32a（+）-du AVBD7-His质粒并转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,探索所获重组蛋白的表达条件,发现在IPTG终浓度为1.0 mmol/L、诱导温度30℃以及诱导时长6 h的条件下所获重组蛋白的表达量最大,并通过SDS-PAGE及Western blot等方法进行验证。结果显示,经诱导后获得大小为26.8 KDa左右的重组蛋白AVBD7,与预期结果相同,表明鸭AVBD7可以在大肠杆菌中表达。综上所述,本研究建立的荧光定量检测方法灵敏性强、重复性好,并应用此检测方法发现AVBD7在健康鸭的组织中广泛分布。不同类型的细菌感染樱桃谷肉鸭后,鸭AVBD7在脑、肝脏和脾脏中的表达量均显著上调,表明这鸭AVBD7参与宿主的抗病毒反应,同时验证了鸭AVBD7在大肠杆菌中可以成功表达,为以后临床应用奠定基础。