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目的:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类高度异质性的侵袭性血液病,主要由于髓系细胞的分化成熟障碍、恶性克隆性增殖引起。AML中最常见的染色体易位为t(8;21)(q22;q22),并可形成AML1-ETO融合基因。已知AML1-ETO融合蛋白的单独表达并不能导致白血病发生,还需要其他基因异常的同时存在才能引起白血病。因此本研究在AML1-ETO阳性AML患者中应用人类全基因组甲基化芯片技术筛选出相关性和特异性均较高的EYA4基因,旨在探讨AML1-ETO融合基因调控EYA4的表观遗传学机制以及EYA4表观遗传学沉默参与t(8;21)AML发生的机理,从而为AML的治疗提供潜在的新靶点。方法:本研究在AML1-ETO阳性AML患者中应用人类全基因组甲基化芯片技术筛选出特异性高甲基化状态的EYA4基因。通过定性PCR、定量RT-PCR和蛋白免疫印迹的方法观察EYA4基因在AML1-ETO阳性和阴性细胞系中mRNA和蛋白表达水平的变化。通过生物学信息分析发现EYA4基因上游的启动子区(-523bp)含有1个AML1结合位点后通过构建不同的荧光素酶报告载体质粒及其突变体质粒进行双荧光素酶活性检测,以探索AML1-ETO在EYA4启动子区的结合情况。应用染色质免疫共沉淀技术研究AML1-ETO使EYA4表观遗传学沉默的机制,并采用硫化测序技术检测EYA4启动子区的甲基化状态。应用转染技术将pcDNA3.0-EYA4和EYA4-siRNA分别转染入AML1-ETO阳性和阴性细胞系,并使用CCK-8、流式细胞术和克隆形成实验检测EYA4对细胞增殖、凋亡和细胞克隆形成能力的影响。结果:定性PCR、定量RT-PCR和蛋白免疫印迹实验表明AML1-ETO阳性细胞系(Kasumi-1和SKNO-1)的EYA4mRNA和蛋白表达水平均显著下调,双荧光素酶活性检测证实AML1-ETO可以结合到EYA4的启动子区并可能参与EYA4基因表达水平的调控。染色质免疫共沉淀实验发现AML1-ETO可以募集HDAC1和DNMTs,使EYA4基因发生表观遗传学沉默。硫化测序结果表明AML1-ETO阳性AML白血病细胞中EYA4启动子区出现高甲基化状态。细胞增殖和克隆形成实验表明EYA4基因对细胞(尤其是AML1-ETO阳性细胞系)的增殖和克隆形成能力有抑制作用,而使用RNA干扰技术抑制EYA4的表达后,细胞增殖和克隆形成能力显著增加。细胞凋亡实验则发现EYA4对于细胞凋亡无明显影响。结论:人类EYA4基因可能是抑癌基因,在t(8;21)AML中该基因出现特异性的高度甲基化状态和低水平表达,可能会加剧白血病细胞恶性增殖,从而加速白血病的发展。AML1-ETO能够结合在EYA4的启动子区并募集表观遗传学修饰酶类,从而使EYA4基因表达沉默。EYA4基因的过表达可以抑制白血病细胞的恶性增殖,提示可能是一个潜在的新治疗靶点。