婴幼儿血管瘤是一种婴幼儿期较为常见的内皮细胞良性肿瘤。该肿瘤通常具有增殖期、消退期和消退完成期的临床病理特征。患者在出生后3-6个月发病并迅速进入增殖期。该病一般在患者3-7岁可自发出现消退。在增殖期,由于血管瘤内血流量迅速增加,瘤体快速增殖,可使肿瘤体积明显增大,从而对周围组织器官造成压迫症状。多发者可伴随其它相关病理表现。在消退期,肿瘤瘤体停止生长,并自发消退。多数患儿可不残留明显皮肤改变。但部分婴幼儿血管瘤因其深在,或者并发其他疾病,可导致严重的并发症。某些病例中最终残留的病变可影响患儿正常生活。目前对于婴幼儿血管瘤的治疗方法已逐渐统一,但是还没有一种治疗方法是完全有效和没有副作用的。这主要是因为对于其发病机制还没有完全研究清楚。目前普遍认为,相对于增殖期,消退期的婴幼儿血管瘤中内皮细胞的凋亡是一个重要的促进因素。miRNA又称为微小RNA,是一类自然界中普遍存在的小分子RNA。该类RNA对于维持机体内环境稳定,调控细胞和组织分化有重要意义。该类RNA并不通过编码蛋白质发挥作用,而是通过识别特定靶目标的m RNA,降解m RNA或部分抑制m RNA的表达,从而抑制靶目标蛋白的形成和发挥作用。目前有诸多文献均认为,在肿瘤中miRNA与细胞凋亡有着重要的关系。在前列腺癌中[1],miRNA-34可以下调Bcl-2蛋白表达,从而抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。在恶性胶质瘤中[2],miRNA-153可以通过下调Bcl-2蛋白表达,促进细胞凋亡。在直肠癌中[3]存在着低表达的miRNA-195。通过在直肠癌细胞内高表达miRNA-195,可以促进直肠癌细胞的凋亡。我们之前对增殖期及消退期的婴幼儿血管瘤组织进行差异micro RNA芯片检测和筛选,发现mi R-29a-3p在不同期的组织中差异明显,且在消退期的婴幼儿血管瘤组织中明显高表达。同时,在诸多文献中,均发现mi R-29家族成员可以通过作用于凋亡相关因素而抑制肿瘤的发展。通过实验[4]发现,在恶性肝细胞癌细胞株中,mi R-29a可调控抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2,从而导致肝癌细胞的凋亡。在慢性淋巴细胞白血病、肺癌、乳腺癌中,mi R-29a均表达下调。上调mi R-29a表达可以激活P53的表达,并抑制CDC42、Tcl-1等多种增殖相关基因的表达,促进肿瘤细胞的凋亡。通过本研究,我们试图探讨mi R-29a对婴幼儿血管瘤生物活性的影响,以及在婴幼儿血管瘤消退中的作用及其机制。以期对进一步了解婴幼儿血管瘤自发消退的机制有所裨益。第一部分:婴幼儿血管瘤内皮细胞的培养及鉴定实验目的通过原代细胞培养的方法,获得可用于实验的增殖期婴幼儿血管瘤内皮细胞。实验方法1、无菌条件下收集手术中新鲜的增殖期婴幼儿血管瘤标本,于6小时内转入实验室超净台中。以组织块贴壁培养法处理并培养血管瘤组织。培养数周后,获取其周围爬出的细胞,通过酶消化法收集。经过传代再培养。传至3-4代,细胞量足够时,收集并以CD31免疫磁珠分选,获得CD31阳性细胞。将细胞进行CD31-FITC的流式细胞学检验,以保证阳性细胞率达90%以上。2、将获得的高纯度的CD31阳性细胞进行培养,在倒置相差显微镜下观察其生长形态,并绘制生长曲线,行Matrigel基质胶成管实验,以确定该细胞的生长特性。3、通过CD31、v WF、Glut-1、VEGFA的细胞表面标志物免疫荧光检测,以明确该细胞为可用于下一步实验的婴幼儿血管瘤内皮细胞。实验结果1、通过对增殖期婴幼儿血管瘤新鲜标本组织块的培养,细胞的收集、扩增、传代、并经CD31免疫磁珠分选,获得了足够量的细胞。通过CD31-FITC的流式细胞学检验,所获得CD31阳性细胞率为96%左右。2、获得的细胞通过培养,在倒置相差显微镜下观察,可见其形态为梭形,生长较为杂乱。生长曲线显示其具有较为旺盛的增殖活性。Matrigel基质胶成管实验显示其具有早期成管能力。3、通过CD31、v WF、Glut-1、VEGFA的细胞表面标志物免疫荧光检测,可见该细胞上述表面标志物表达均为较强阳性。实验结论我们通过收集增殖期婴幼儿血管瘤标本,并经体外扩增培养并获得细胞。经形态学及免疫荧光抗体检测,其特征均符合文献的一般描述,证实为所需婴幼儿血管瘤内皮细胞。经流式细胞仪检测,该细胞纯度较高,活力较强,可用于下一步实验。第二部分:上调mi R-29a对婴幼儿血管瘤内皮细胞生物活性的影响实验方法1、体外构建能够转染并可在细胞内稳定表达mi R-29a的慢病毒颗粒Lv-hsa-mi R-29a及阴性对照病毒Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin。2、以自身细胞作为阴性对照组,以Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin转染的细胞作为阴性病毒转染组,以Lv-hsa-mi R-29a转染的细胞作为慢病毒转染组。通过荧光显微镜观察其荧光表达情况。通过q RT-PCR检测细胞在转染前后mi R-29a表达的变化,从而确定其转染效率。3、在婴幼儿血管瘤细胞内过表达mi R-29a后,采用MTT法检测其增殖能力的改变。流式细胞仪检测其周期及凋亡水平的改变,Transwell侵袭法检测其侵袭能力的改变,以研究过表达mi R-29a对婴幼儿血管瘤内皮细胞生物活性的影响。实验结果荧光显微镜下观察,FITC荧光表达显示mi R-29a转染效果良好,转染效率约为95%左右。q RT-PCR结果显示mi R-29a在婴幼儿血管瘤内皮细胞中的表达丰度为中等,转染慢病毒颗粒后,mi R-29a基因的表达丰度是阴性对照组的2.643倍。转染病毒后72h,过表达mi R-29a的婴幼儿血管瘤内皮细胞中,其早期凋亡率约为10.82%,较阴性对照组及阴性病毒转染组有显著性差异。其晚期凋亡率约为1.72%,较阴性对照组有显著性差异。而细胞周期、侵袭及增殖实验结果均无显著性差异。实验结论通过转染慢病毒颗粒Lv-hsa-mi R-29a,可以构建稳定高表达mi R-29a的细胞模型。过表达mi R-29a后,婴幼儿血管瘤内皮细胞的凋亡率有显著性变化.。而对于细胞周期、增殖及侵袭均无显著性影响。第三部分:mi R-29a在婴幼儿血管瘤中作用机制的研究实验方法1、以mi R-29a过表达后的婴幼儿血管瘤细胞作为目标样本,以自身细胞作为阴性对照,采用miRNA基因表达谱芯片筛选的方法,获得两者之间有较大表达差异的m R NA表达谱。通过与Target Scan数据库进行比对,结合之前细胞功能学研究结果,参考相关文献,选取可能为mi R-29a下游的靶基因作验证。2、通过双荧光素酶检测显示,mi R-29a的下游作用分子可能为Mcl-1分子。3、通过Western-blot检测的方法,进一步验证在过表达mi R-29a的婴幼儿血管瘤内皮细胞中,Mcl-1、VEGFA及Bcl-2蛋白水平是否有显著性变化。4、通过查阅文献及相关数据库,我们选取Stat3及Akt3这两个可能同时是Mcl-1上游及mi R-29a下游靶蛋白的分子加以验证,进一步研究mi R-29a是否通过调控Mcl-1上游分子表达以调控Mcl-1表达的可能。实验结果参考miRNA芯片筛选、数据库分析结果及相关文献,我们获取相关分子作为mi R-29a可能的下游靶蛋白并进行验证。通过双荧光素酶检测确定Mcl-1具有与mi R-29a结合的相关位点,其为mi R-29a可能的下游分子。通过Western-blot检测,证实了Mcl-1、VEGFA及Bcl-2蛋白水平均有显著性变化。同时,通过Western-blot检测,证实了Stat3及Akt3蛋白水平无显著性变化。实验结论双荧光素酶检测发现,mi R-29a与Mcl-1是直接相互作用并且可以找出相互作用的结合位点。通过Western-blot检测,在过表达mi R-29a的婴幼儿血管瘤血管瘤内皮细胞中,Mcl-1、VEGFA及Bcl-2蛋白表达明显下调。而mi R-29a与Mcl-1的上游分子Stat3和Ark3没有表达相关性,mi R-29a并不能抑制或者激活Stat3和Ark3的表达。