大段骨缺损的修复是临床面临的一大难题,目前尚未得到很好地解决。近年来组织工程的发展有望成为治疗大段骨缺损的新方法,但组织工程化的人工骨用于大段骨缺损的治疗时有一个关键性的问题必需克服,即人工骨血管化的问题。因为是否血管化决定了植入体内的人工骨能否成活。血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素(Ang-1)是两个在血管形成及塑型过程中起重要作用的两个细胞因子,本研究使用重组腺病毒将这两个具有高效促血管形成能力的细胞因子的基因转导入骨髓基质干细胞(MSCs),基因转染后的MSCs作为种子细胞与I型胶原改性的PLGA-TCP材料复合,构建新型的双基因修饰的组织工程化人工骨,以期在采用组织工程化人工骨治疗大段骨缺损时能促进人工骨的血管化,进而有效修复骨缺损。1. VEGF与Ang-1基因的克隆及腺病毒的制备目的:制备同时携带VEGF和Ang-1基因的腺病毒,为构建新型双基因修饰的组织工程化人工骨提供方便的基因转染工具。方法:采用分子生物学的方法设计、合成引物,使用PCR的方法从组织中克隆出基因VEGF以及基因Ang-1,在克隆基因Ang-1时设计使用了net-PCR的方法以提高PCR反应的灵敏度。同样使用PCR技术从载体pIRES2-EGFP上扩增IRES序列,继而将基因VEGF、IRES片度以及Ang-1的基因依次装入腺病毒的穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建双基因顺反子P-VIA。最后使用AdEasyTM腺病毒系统重组并包装腺病毒。结果:从组织中成功地克隆出VEGF的基因序列,DNA测序结果显示克隆出的序列与Genebank中的序列完全一致;Ang-1的基因通过net-PCR提高反应的灵敏度后也成功获得,DNA测序结果与Genebank中的序列完全一致;扩增出的IRES的DNA片段与商品化的载体pIRES2-EGFP中的序列完全一致。三个基因片段顺次装入载体pAdTrack-CMV后成功的构建出同时编码VEGF和Ang-1的双顺反子,命名为P-VIA,经过AdEasyTM系统重组与包装后,成功的制备出能够同时携带外源基因VEGF和Ang-1的重组腺病毒,命名为pAd-VIA。类似的过程制备出单独携带基因VEGF的重组腺病毒pAd-VEGF,以及单独携带基因Ang-1的重组腺病毒pAd-Ang-1。结论:成功制备出同时携带VEGF和Ang-1的重组腺病毒pAd-VIA,为构建新型基因修饰型的组织工程化人工骨提供了方便的基因转导工具。2.双基因转染MSCs体外促血管化能力研究目的:研究双基因(VEGF、Ang-1)转染后的MSCs在体外促血管化的能力,为构建新型双基因修饰的组织工程化人工骨打下实验基础。方法:从兔骨髓中分离、培养MSCs,进行成骨方向诱导、鉴定;腺病毒以感染复数(multiplicity of infection ,MOI)分别为0、1、10、50、100、300感染MSCs以确定最佳的感染复数(multiplicity of infection,MOI);以确定的最佳的感染复数的腺病毒感染MSCs,分组如下:A:腺病毒pAd-VIA;B:腺病毒pAd-VEGF;C:腺病毒pAd-Ang-1;D:腺病毒pAd-VEGF+ pAd-Ang-1;E:空病毒对照组。在mRNA水平及蛋白水平检测外源基因的表达情况;从人外周血分离、培养、鉴定血管内皮祖细胞(EPCs),将基因转染后的MSCs与EPCs共培养,分组如下:A:腺病毒pAd-VIA;B:腺病毒pAd-VEGF;C:腺病毒pAd-Ang-1;D:腺病毒pAd-VEGF+ pAd-Ang-1;E:未转染对照组;F:重组VEGF蛋白组;G:EGM-2培养基对照组,感染后进行EPCs的增殖实验以及移行实验检测。结果:分离、培养出MSCs,并成功的向成骨方向诱导(经碱性磷酸酶及钙结节染色鉴定);不同感染复数(MOI)的腺病毒感染MSCs后,发现MOI=100时,既可实现外源基因的高效表达,也不至对宿主细胞造成过度的损伤;各组腺病毒感染MSCs后,外源基因的表达均可持续3w左右,表达的高峰出现在在8-9d。VEGF的表达情况:A组(腺病毒pAd-VIA组)VEGF的表达水平与B组(腺病毒pAd-VEGF组)无明显差别,略高于D组(腺病毒pAd-VEGF+ pAd-Ang-1组),C组E组无VEGF的表达;Ang-1的表达:A组(腺病毒pAd-VIA组)有明显高水平的Ang-1的表达,但其表达水平显著低于C组(腺病毒pAd-Ang-1组)与D组的水平(腺病毒pAd-VEGF+ pAd-Ang-1组),C组的Ang-1表达水平最高。B组(腺病毒pAd-VEGF组),E组无Ang-1的表达。EPCs增殖实验显示两个双基因转染的实验组(实验组A,实验组D)促EPCs增殖的能力均强于其它各组,而A,D两组中又以A组的促EPCs增殖的能力较强。促EPCs增殖能力由高到低依次为A组>D组>B组>F组>C组>G组>E组。EPCs移行的实验结果提示A、B、D三个实验组均有促EPCs移行的能力,三个组间没有统计学差异。结论:双基因转染的MSCs在体外具有良好的促血管化的能力,且使用腺病毒pAd-VIA实现双基因的共转染的效果要强于联合使用腺病毒pAd-VEGF和pAd-Ang-1。3.双基因转染MSCs促进SD大鼠缺血皮瓣存活的研究目的:探讨双基因转染的MSCs在体内促进血管化的能力,为构建双基因修饰的工程化人工骨并用于体内修复骨缺损提供理论依据和实验基础。方法:体外培养大鼠的MSCs并进行双基因转染;在SD大鼠的背部建立1.5cm×4.0cm的缺血皮瓣模型,将MSCs植入体内观察皮瓣存活情况。实验分组:A组:双基因转染的MSCs;B组:未转染基因的MSCs;C组:培养基DMEM对照组。27只动物完全随机分入A、B、C三组,每组9只动物。MSCs悬浮于DMEM后在皮瓣边缘多点注射,术后4天断蒂。皮瓣术后即刻、24h、48 h及第4天断蒂前、断蒂后、第7天及第14天应用激光多普勒血液监测仪对皮瓣中点及蒂部进行皮瓣的血流灌注学检测;皮瓣术后14天,应用微循环显微镜观察皮瓣蒂部及中点处的基底部毛细血管密度;分别在皮瓣术后第1、4、7、14、28天抽取外周血标本进行VEGF及Ang-1蛋白的ELISA检测;术后11天取材,进行组织学检测,包括HE染色,CD34免疫组织化学染色以及荧光显微镜观察MSCs移植体内后的增殖情况。结果:皮瓣术后11天,大体观察,A、B、C 3组皮瓣存活率分别为: 97.12%、47.28%、34.12%,A组与B组两组间及B组与C组两组间皮瓣存活率差异均有统计学意义。A组(双基因转染的MSCs组)的血流灌注学指标(PU值)明显高于实验组B及对照组C;微循环显微镜观察皮瓣基底部毛细血管密度结果显示,A组(双基因转染的MSCs组)血管密度显著高于其它两组;术后11天,组织学检测的结果包括H.E.染色、免疫组织化学及免疫荧光的结果均显示A组(双基因转染的MSCs组)中毛细血管远远多于B组及C组。植入体内的MSCs由于标记有荧光染料CM-DiI,在荧光显微镜下观察荧光的多少以反映MSCs的增殖,结果显示A组中MSCs增殖较B组明显。结论:双基因转染的MSCs在体内具有显著的促血管化的活性。4.双基因修饰组织工程化人工骨的构建及其初步应用研究目的:构建新型双基因修饰的组织工程化人工骨,并研究该人工骨修复兔桡骨缺损的能力。方法:快速成型技术制备多孔材料PLGA-TCP,使用I型胶原对制备的材料PLGA-TCP进行杂化改性;电镜观察材料改性前后的微观结构,并检测改性前后材料的亲水率;将转染双基因及未转染基因的MSCs分别与改性前后的材料复合,检测细胞在材料中的增殖,ELISA检测转染基因的MSCs在材料中表达外源基因(VEGF,Ang-1)的能力;建立兔桡骨1.5cm骨缺损模型,将改性后的材料修剪成1.5cm×0.4cm×0.4cm大小,复合细胞后植入体内,分组:A组:双基因转染的MSCs+改性的PLGA-TCP;B组:未转染基因的MSCs+改性的PLGA-TCP;C组:单纯改性的PLGA-TCP;D组:空白对照组。术后1、4、8周取材,进行影像学(X Ray,MciroCT)检测及组织学检测。结果:快速成型技术制备的材料PLGA-TCP电镜下观察为规则、多孔的相互交通的三维立体结构。该材料具有良好的孔隙率(>90%)以及孔径(300μm-350μm)。使用I型胶原改性后在扫描电镜下观察可见胶原纤维均匀分布于材料表面及孔隙中,并形成网状结构,PLGA-TCP的亲水率为3.06±0.67%,改性后材料的亲水性有显著提高达到12.42±1.45%,由于改性后材料的亲水性提高,接种细胞时细胞悬液漏出的少,细胞接种密度高,细胞与材料体外共培养7天后,电镜观察,细胞与材料紧密贴附。细胞的增殖实验结果显示,改性后的材料中的细胞数量明显多于未改性的材料中的数量,而相同的材料中,未转染基因的细胞的数量略多于转染双基因的细胞的数量,但差别不明显。ELISA结果证实,转染双基因的MSCs在与材料复合后依然能够高效的表达外源基因(VEGF和Ang-1)。兔桡骨1.5cm骨缺损模型成功建立,人工骨植入后1、4.、8周取材,1周时,组织学标本进行CD34免疫组织化学染色的结果显示A组(双基因转染MSCs+改性的PLGA-TCP)中有大量的毛细血管,而B组(未转染基因的MSCs+改性的PLGA-TCP)中血管数量明显少于A组,C组(单纯材料组)则没有毛细血管的生成,A、B、C三组的毛细血管密度(条/mm2)分别为:100.00±15.81、24.00±11.40、0.10±0.00,A组与B组之间差异有统计学意义(P<0.01)B组与C组之间差异也有统计学意义(P<0.05)。进行改良丽春红三色法染色发现A组中有大量的软骨陷窝形成,而B组中软骨陷窝明显少于A组,实验组C未见软骨陷窝形成。4周时,影像学检查显示实验组(A组)桡骨骨缺损部位有新骨影像形成,新骨与骨缺损两断端骨质连续。实验组B也可见有新骨影像形成,但新骨面积少于实验组A,对照组C有少量新骨形成,空白对照组D无新骨形成。Lane-Sandhu X线评分结果显示,A组与B组之间,B组与C组之间均存在统计学差异(P<0.05)。组织学检验显示实验组A中可见明显的编织骨形成,材料已部分降解;实验组B中可见少量的骨形成,但数量远少于A组,材料降解也少于A组;实验组C仅在边缘处有少量的骨形成。A、B、C三组新生骨组织面积比(%)分别为:20.18±6.29%、9.48±1.87%、0.2±0.15%,A组与B组之间,B组与C组之间均存在统计学差异(P<0.05)。A、B、C三组材料残存面积比(%)分别为70.7±8.23、83.78±6.70、93.72±3.13,A组与B组之间,B组与C组之间均存在统计学差异(P<0.05)8周时影像学检验实验组A中桡骨缺损部位已完全被新生骨所填充,骨缺损部位塑形良好,桡骨骨折端模糊,新生骨与桡骨骨折端之间界限模糊,Micro CT重建后可见骨缺损部位形成的新骨结构连续、完整、规则,骨缺损修复明显,新骨中残存少量未降解的支架材料。实验组B骨缺损部位为新骨所填充,填充面积约占80%,新骨面积少于实验组A,与A组对比塑形较差,桡骨骨折端模糊,新生骨与桡骨骨折端之间界限模糊,Micro CT重建后可见形成的新骨结构不规则,新骨结构中散在未降解的支架材料,但成骨量明显少于实验组A。C组的新生骨量极少,Micro CT重建后只能看到零星的新生骨结构。空白对照组D未见成骨,桡骨保持了骨缺损状态。Lane-Sandhu X线评分结果显示,A组与B组之间,B组与C组之间均存在统计学差异(P<0.05)。组织学检验显示A组中有大量的编织骨形成,成骨量较4周时有明显的增加,形成小梁样结构,可见骨髓样结构形成,材料多数降解;B组也有明显的编织骨形成,但骨量明显少于A组,材料已部分降解,C组只在材料边缘有少量的骨形成。A、B、C三组新生骨组织面积比(%)分别为:51.30±4.80%、20.64±3.28%、2.58±1.92%,A组与B组之间,B组与C组之间均具有统计学差异(P<0.05)A、B、C三组材料残存面积比(%)分别为43.00±3.78、67.16±9.32、88.8±5.99,A组与B组之间,B组与C组之间均具有统计学差异(P<0.05)结论:成功的构建出新型双基因修饰人工骨,并经实验初步证实该新型人工骨具有良好的促进新生血管形成的能力,进而能够促进新生骨组织的形成。