目的:动物药是我国中药的重要组成部分,早在《神农本草经》中就有记载。由于动物药野生资源短缺、养殖技术不成熟等原因使其价格昂贵,市场上存在大量的伪品,甚至同科属动物来冒充正品,以假乱真,不易识别。快速鉴别动物药的真伪成为一个亟待解决的问题,本研究主要通过微性状鉴别的方法对乌梢蛇及其混淆品进行鉴别,并拍摄其3D高清特征图,再通过DNA条形码鉴别对微性状鉴别结果进行验证。另外对其性状和显微、重金属含量、浸出物含量以及氨基酸相对含量进行系统研究,保障临床用药的安全性和有效性。方法:1.微性状鉴别:本研究对市售乌梢蛇进行收集,采用3D技术对乌梢蛇头部及体部的鳞片、鼻骨、顶骨、椎骨进行微性状鉴别。随机选取乌梢蛇及其混淆品椎骨（n=100）,对其棘突的高度与整个骨骼高度比值进行测量,用SPSS22.0软件进行统计学分析。2.DNA条形码鉴别:采用聚合酶链式反应法（Polymerase Chain Reaction,PCR）,提取样品的DNA,利用Cytb引物进行PCR扩增并测序,MEGA5.1软件进行分析,并采用邻接法（NJ）构建系统聚类树。3.乌梢蛇及其混淆品的质量评价研究:对乌梢蛇及其混淆品性状和显微进行鉴别;电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）对其铅（Pb）、镉（Cd）、汞（Hg）、砷（As）进行含量测定;热浸法对乌梢蛇的醇溶性浸出物进行测定;采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）法对乌梢蛇及其混淆品的氨基酸相对含量进行测定。结果:1.市场上乌梢蛇的品种较为混乱,共有样品36份,12份为正品乌梢蛇Zaocys dhumnades（Cantor）,其它均为混淆品。其中7份为滑鼠蛇Ptyas mucosa（Linnaeus）、8份为灰鼠蛇Ptyas korros（Schlegel）、3份为舟山眼镜蛇Naja atra Cantor、1份为黑眉锦蛇Orthriophis taeniurus Cope、1份为王锦蛇Elaphe carnata（Cunther）、3份为闪鳞蛇Xenopeltis unicolor Reinwardt、1份为Cerberus rynchops（Colubridae）与之前研究所报道的伪品有所不同。通过鉴别颊鳞、体部鳞片类型、鳞片端窝、薄膜囊、纵直条纹、基部指纹样纹理以及鼻骨和顶骨的形态、椎骨棘突的高度等可以将乌梢蛇正品与混淆品区分开。统计学分析结果显示,乌梢蛇的棘突高度与整个椎骨高度比值与其混淆品之间有显著性差异,其棘突高度最高,为2.82～5.80 mm,这与传统性状鉴别中“剑脊”一词相对应。2.经DNA条形码鉴别并进行聚类分析,显示不同蛇类分成不同种类,每个品种均有良好的单系性。与微性状鉴别结果一致,证明微性状鉴别的准确性、可靠性,可以达到快速鉴别的目的。3.乌梢蛇重金属含量测定结果表明砷（As）含量易超标,个别样品As含量超出规定值5倍。醇溶性浸出物基本符合2015年版《中国药典》中醇溶性浸出物的规定。通过GC-MS法共检测到脯氨酸、D-脯氨酸、亮氨酸、D-亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、羟基脯氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸共16种氨基酸,相对含量最高的为甘氨酸,最低为异亮氨酸。其中丙氨酸的相对含量在正伪品中有显著性差异。结论:1.经DNA分子验证,微性状鉴别的方法所寻找的乌梢蛇鉴别特征稳定,不易随外界的变化而改变。采用以上鉴别特征对乌梢蛇的药材、饮片都能进行准确的鉴别。2.乌梢蛇砷（As）的含量易超标,醇溶性浸出物基本符合2015年版《中国药典》规定。乌梢蛇与其混淆品的丙氨酸相对含量有显著性差异,其余氨基酸的相对含量无明显差异。3.微性状鉴别运用3D景深合成技术和3D大图拼接技术可以拍摄乌梢蛇的正品及其混淆品的3D高清特征图,为乌梢蛇的鉴别提供了有力的鉴别依据。该方法操作简单、使用方便、成本低,适合大面积推广使用,是现场快检的一种重要手段。