锥栗(Castanea henryi Rehd. & Wils.)是闽北地区特色果树资源,具有多种经济用途,但由于生产上长期存在空棚现象,一定程度上影响了该产业的发展。本试验通过硼酸溶液作处理,运用蛋白双向电泳技术、质谱鉴定及生物信息学的研究方法,分析锥栗叶片及幼胚中的蛋白差异,以求揭示硼元素促进植株正常生长发育、提高坐果率的分子机制。1.建立酚抽提法的蛋白质提取技术。开展两种不同提取方法的比较研究,确立了用酚抽提法提取锥栗叶片及胚中蛋白质,结果发现大多数蛋白质集中在pH5-8范围内。得到的双向电泳的总的蛋白质点1185个。2.开展了硼酸溶液处理的叶片及幼胚的差异蛋白组学研究。通过建立锥栗叶片和幼胚的双向电泳技术体系及蛋白图片分析软件进行分析,结果表明:硼处理叶总蛋白点比未处理叶多88个点,增加的点多数集中在酸性端;从分子量角度讲,增加的点多数集中在中等分子量区间。挖取其中表达丰度差异在二倍以上的13个差异蛋白,做进一步的质谱鉴定,成功鉴定出7个,分为4类,分别为参与光合作用相关蛋白类(核酮糖1,5-二磷酸羧化酶大亚基结合蛋白亚基α,核酮糖1,5-二磷酸羧化酶)、抗逆性蛋白类(小热休克蛋白1,压力和病程相关蛋白)、无名蛋白及未知蛋白类。未知蛋白为未处理叶所特有,可能为缺硼胁迫密切相关;参与光合作用、抗逆性蛋白及无名蛋白特异存在处理叶中,可能是受硼元素所诱导的与叶片的正常发育密切相关的蛋白质。未处理胚比处理胚中多了137个点。未处理胚中增加的蛋白点,从等电点角度讲,pI5-6范围内增加最多;从分子量角度讲,增加的多数是66.2 KDa以上的蛋白点,在35 KDa以下范围,蛋白点不增反降。进一步做质谱分析鉴定出了16个,其中处理胚2个差异蛋白,均属于抗逆性相关蛋白(假定富含甘氨酸RNA结合蛋白,pHi类谷胱甘肽转移酶GSTF3),可能是硼依赖型抗逆蛋白。未处理正常胚中差异蛋白14个,分为5类,分别属于抗逆性相关蛋白(凝集素、小热休克蛋白1)、能量代谢类相关蛋白(DNA结合相关蛋白、NADH脱氢酶1α亚单位亚基5)、信号转导类相关蛋白(水解酶/蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶、受体类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)、细胞骨架(纤维蛋白-1、纤维蛋白-6)及未知蛋白,这些差异蛋白协同互作以使胚胎抵抗缺硼所带来的所有胁迫,保证胚胎的正常发育。3.开展了锥栗胚不同发育状态的差异蛋白质组学研究。用双向电泳技术及蛋白图谱分析软件分析,得到不同发育状态胚中差异蛋白,结果发现正常胚比空棚胚中多出170个蛋白点,增加的差异蛋白从酸性端至pH7端依次减少;从分子量角度讲,在66.2KDa以上的蛋白区域增加最多,各区域占总蛋白点比例,两组变化不大。挖取表达丰度差异在二倍以上的差异蛋白13个,做进一步质谱分析,成功鉴定了3个点,其中空棚胚中2个,分别为信号转导(亲环蛋白)及抗逆性相关蛋白(小热休克蛋白),亲环蛋白可能参与胚细胞的凋亡过程。正常胚中差异点1个,为蛋白合成相关蛋白(酸性核糖体蛋白P2),可能参与合成胚胎正常生长发育所必需相关蛋白或酶类。