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芳香烃化合物是一类广泛存在于环境中的化学物质,广泛应用在化工,印染,农药等领域。由于其苯环结构的稳定性和脂溶性,对环境和人类健康带来极大危害。利用微生物进行的生物修复是芳香烃类化合物污染治理的有效手段之一,如何提高微生物对芳香烃化合物的降解效率已经成为该领域研究的热点。因此研究芳香烃化合物的降解机制和调控机理,对于解决这类环境问题具有重要意义。
Klebsiella pneumoniae M5a1是一株土壤细菌,该菌在固氮方面研究的较多,同时该菌也是一株重要的工业菌株,用于生产某些化工产物,如1,3-丙二醇。该菌可以利用3-羟基苯甲酸(3-hydroxybenzoate,3HBA)作为唯一碳源生长。Klebsiellapneumoniae M5a1代谢3HBA经龙胆酸途径早在1975年就有报道,近年来对参与该途径的酶基因mhbDHIM已经在分子生物学水平、酶学水平得到了很好的研究,但对于该途径的调控机理的研究还存在着空白。
mhbR位于代谢基因mhb TDHIM的上游,并且与代谢基因的转录方向相反。它编码一个37kDa的蛋白MhbR,经序列比对发现MhbR属于LysR家族调控蛋白。体外的敲除和互补实验证明MhbR对于表达3HBA代谢基因的酶是必需的,在MhbR存在的条件下,代谢基因的表达是需要诱导的。
LysR家族调控蛋白所调控的代谢基因经常位于一个操纵子上,通过RT-PCR的方法,鉴定了代谢基因mhb TDHIM位于一个操纵子上,通过5RACE的方法定位了调控基因mhbR和代谢基因mhb TDHIM的转录起始位点,在mhbR和mhb TDHIM基因之间发现了两个重叠的大肠杆菌σ70的启动子结构,这与LysR家族的特点一致。通过5’端逐步缺失来分析启动子活性的方法,确定了代谢基因相对于转录起始位点上游-144至+89的区域对于代谢基因的诱导表达是必需的。
对于代谢基因启动子上游基因进行序列分析发现,在启动子上游-70到-55(site1),-45到-26(site2),-17到-5(site3)三个区域存在着三个不完全的反向重复序列。通过序列缺失的β-半乳糖苷酶活性实验以及电泳迁移率实验证明了该三个反向重复序列在诱导调控以及本底表达的过程中起着关键的作用。其中sitel是调控蛋白MhbR识别的关键位点,同时该位点也是诱导表达必需的位点。其中stie2是调控蛋白的另外一个结合位点,该位点相对于site1的结合能力要弱,同时site2与MhbR的结合必须要在site1存在的情况下,β-半乳糖苷酶活性同时也证明了该位点对于诱导表达是必需的。Site2和site3位于代谢基因的启动子的-35和-10区,该位点的缺失对代谢基因的本底表达有影响。