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睾丸是精子生成和分泌雄性激素的场所，是雄性哺乳动物最重要的生殖器官。小鼠的zfx基因位于X染色体短壁上的性别决定区（TDF）内，是锌脂蛋白家族中的一员。zfx可以作为一个较强的转录激活因子，从而引导靶基因通过核膜定位在X精子的细胞核内，可能对某些基因在X精子发生过程中具有转录激活作用，与X精子的形成发生有关。本研究根据zfx基因的特点，设计了4个shRNA片段，进行小鼠体外和体内zfx基因的RNAi实验，采用qRT-PCR分析干扰后zfx基因的mRNA表达水平，并统计了经干扰后子代小鼠的性别比例。具体研究结果如下：1.根据GenBank(NCBI)提供的完整的小鼠zfx基因mRNA序列，按照RNAi设计原则，针对该基因的编码区设计并合成4对shRNA干扰片段。以Clontech公司（USA）RNAi-Ready-pSIREN-RetroQ-ZsGreen作为载体，构建了小鼠靶向zfx基因的shRNA表达载体pqz1-paz4。经过酶切鉴定和测序证实，实验所构建的4个表达载体中含有设计合成的干扰序列，且上下游表达调控元件完整，插入序列的位置正确。说明这4个shRNA表达载体构建成功，可以用于小鼠zfx基因的干扰试验。2.将构建好的4个zfx基因shRNA重组质粒表达载体进行小鼠体外RNAi的研究。选取28日龄健康的雄性昆明小鼠，在无菌条件下取睾丸组织采用两步酶消化法分离小鼠生精细胞，并用生精细胞与支持细胞共培养的体系进行体外培养。以转染试剂（HET）分别包裹构建好的4个zfx基因shRNA重组质粒表达载体，用包裹好的质粒对培养24h后的生精细胞进行转染。转染48小时后利用荧光实时定量PCR检测zfx基因mRNA的表达水平。初步筛选出4个对zfx基因干扰效果较好的shRNA重组质粒表达载体（pqz1-pqz4）。3.将筛选的4个zfx基因shRNA重组表达载体进行小鼠体内RNAi试验。选取80只健康雄性昆明小鼠随机分成五组（每组16只）。第一组到第四组为实验组，分别注射重组质粒表达载体pqz1-pqz4，第五组为对照组，注射同等体积的生理盐水。间隔7天注射一次，连续注射4次。最后一次注射14天后，每组8只雄鼠1:1与雌鼠交配，另外8只采集睾丸组织，利用荧光实时定量PCR检测zfx基因mRNA的表达水平。结果表明，pqz1-pqz4干扰后zfx基因的mRNA表达水平与对照组都差异极显著(P<0.01)。而子代小鼠性别统计显示，pqz3组的雄鼠率为75.79%，与对照组相比差异显著(P＜0.05)；pqz4组的雄鼠率为79.66%，与对照组相比差异极显著(P＜0.01)。pqz1和pqz2两组子代小鼠的雄鼠率与对照组没有差异。本研究通过沉默zfx基因在生精过程中的表达，限制或损坏了X精子的发育或结构，从而使子代小鼠性别比例发生偏差。但实验组与对照组子代小鼠的数量及体重等无显著差异，表明沉默zfx基因只对X精子有影响而对小鼠胚胎的早期发育不会产生影响。我们还将实验组子一代的雄鼠与雌鼠饲养至性成熟并进行合笼交配，结果显示子二代的数量、性别比例和体重与没有进行试验小鼠的后代均没有任何差异，说明干扰zfx基因所产生的精子受精后不影响后代的繁殖性能。本实验通过干扰zfx基因在X精子细胞中的表达成功实现了对小鼠受精前的性别控制，同时也为其他动物的受精前性别控制方法的研究奠定了基础。