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Deg蛋白酶是一种不依赖于ATP的丝氨酸蛋白内切酶,它广泛的存在于原核和真核生物中。Deg蛋白酶通常包含一个N端的蛋白酶结构域以及0-3个C端的PDZ结构域。拟南芥中存在有16种Deg蛋白,分别被命名为Degl-16。其中Deg1、Deg5和Deg8存在于类囊体膜内测,而Deg2和Deg7分布于类囊体膜基质侧。这五种拟南芥中的Deg蛋白都被发现参与光系统Ⅱ(PSⅡ)的有效修复。目前已有大量的实验表明Degl象大肠杆菌中的DegP一样既具有分子伴侣活性又具有蛋白酶活性,它可以降解类囊体膜内侧蛋白。Deg8具有和Deg1一样的N端蛋白酶结构域以及C端的一个PDZ结构域,它可以与Deg5形成一个复合物。文献报道在体外试验中,Deg1和Deg8都被发现具有降解光损伤的光系统Ⅱ反应中心D1蛋白的能力。我们研究的主要目的是通过结构生物学研究以及一系列的功能实验来了解Deg8和Deg1发挥功能的具体机制。
在本研究中,我们表达纯化了Deg8野生型和活性位点突变的两种突变体的蛋白,长出并优化了Deg8 S292A突变体蛋白的晶体,最终利用分子置换法解析了其2.0(A)分辨率的晶体结构。Deg8 S292A的结构包含两个结构域,N端的蛋白酶结构域和C端的PDZ结构域。在我们所解析的晶体结构中,Deg8以三聚体为其基本的结构单元,两个三体可能会以面对面的方式形成六体。在我们的结构中,Deg8三体中的LA loop、L1 loop和L2 loop和在Deg1以及DegP的24聚体中的相应loop一样,都处于开启的状态,但是由于催化三联体中His171发生了扭转导致其无法与三联体中的丝氨酸和天冬氨酸相互作用,Deg8呈现出一种不具有蛋白酶活性的状态,这与我们体外酶活实验中野生型Deg8没有表现出蛋白酶活性的结果相一致。
同时,我们尝试利用等温滴定量热(ITC)实验来验证Deg1和Deg8蛋白与D1蛋白类囊体腔侧两段loop的相互作用,发现Deg1与D1蛋白的C端loop(Eloop)具有相互作用。通过检测Deg1酶切E loop产生的酶切片段的分子量我们确定出了较准确的酶切位点,并通过突变实验对这一结果进行了验证。我们也设计并合成了包含此酶切位点序列的小肽,并尝试用其与Deg1蛋白共结晶。