衰老性骨质疏松（Senile Osteoporosis）是年龄增长引起的以骨吸收大于骨生成为特征的进行性代谢性疾病，表现为骨量和骨强度的显著降低，具体表现为：皮质骨变薄、骨小梁数目减少、骨密度降低、骨间空隙增大、骨脆性增加，发生骨折的危险性增加。骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal stem cells，BMMSCs）是位于骨髓腔内的具有自我更新能力和多向分化能力的一类中胚层来源的成体干细胞，在成骨、破骨平衡中发挥重要作用，其随着年龄的增长出现数量变化及生物学功能退化，是导致骨骼衰老性变化的重要因素。自噬(Autophagy)是细胞内通过自噬体（Autophagosome）包绕胞浆内底物如折叠错误蛋白质及损伤线粒体等并将其运送至溶酶体（Lysosome）降解后循环再利用的机制，其水平与衰老及衰老性疾病密切相关，但是，自噬在BMMSCs中增龄性变化中起何种作用及作用机制并不清楚，因此本文研究了衰老性骨质疏松中BMMSCs的增龄性变化、自噬变化以及自噬在其增龄性变化中的作用及机制，为衰老性骨质疏松的发病机制及可能的治疗手段的研究提供了新的方向。【实验目的】1．探讨小鼠骨髓间充质干细胞的增龄性变化；2．探讨自噬在自然衰老小鼠骨髓间充质干细胞中的变化；3．探讨自噬在小鼠骨髓间充质干细胞增龄性变化中的作用及作用机制。【实验方法】1．Micro-CT扫描并重建年轻、年老小鼠股骨远端骨小梁形态；采用全骨髓培养法分离培养并纯化年轻、年老小鼠BMMSCs后，流式细胞技术(Flow cytometry,FCM)鉴定细胞表面标志分子；克隆形成实验检测并比较两种BMMSCs的自我更新能力；成骨、成脂诱导实验检测两种细胞的多向分化能力；流式细胞技术检测并比较两种细胞的增殖、细胞周期和凋亡的生物学特性。2．蛋白质印迹法（Western Blot）检测并比较年轻、年老小鼠BMMSCs衰老相关蛋白乙酰化P53、P21、P16的表达以及端粒酶逆转录酶TERT蛋白的表达；活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)试剂盒检测并比较两种细胞的ROS水平。3．实时定量酶连聚合反应法（Real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）检测并比较年轻、年老小鼠BMMSCs自噬相关基因的表达；Western Blot检测并比较两种细胞的自噬相关蛋白分子的表达；免疫荧光染色检测并比较两种细胞中LC3分子的表达；透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）观察两种细胞的自噬体形态及数量。4．Western Blot检测不同浓度自噬诱导剂雷帕霉素（rapamycin）和自噬抑制剂3甲基腺嘌呤（3-methyl-adenine,3-MA）对BMMSCs自噬水平的影响，筛选有效浓度；RT-PCR检测自噬激活剂和自噬抑制剂对年轻、年老小鼠BMMSCs的细胞周期相关基因及细胞凋亡相关基因表达的影响；ROS试剂盒检测自噬激活剂和自噬抑制剂对两种细胞ROS水平的影响。【实验结果】1．Micro-CT结果显示：年老小鼠出现明显骨质疏松；FCM鉴定年轻、年老小鼠BMMSCs表面标记物结果显示：两种细胞表面标记物的阳性和阴性表达均符合间充质干细胞特性；克隆形成实验结果显示：两种细胞均能形成克隆集落，年老组较年轻组的克隆集落小且少，说明年老组细胞自我更新能力低于年轻组；成骨、成脂诱导两种细胞分化后，茜素红，油红O染色证明两种细胞均具有成骨、成脂分化的能力，年老组细胞成骨能力明显低于年轻组，成脂能力明显高于年轻组；FCM检测显示：年老组细胞增殖能力明显低于年轻组（P＜0.05）、细胞周期（G2+S期）明显低于年轻组（P＜0.05）、凋亡水平明显高于年轻组（P＜0.05）。2．Western Blot结果显示：年老组BMMSCs乙酰化P53、P21、P16蛋白分子的表达明显高于年轻组细胞；年老组BMMSCs TERT蛋白分子的表达明显低于年轻组细胞，提示年老组细胞端粒酶活性较年轻组低；ROS试剂盒激光共聚焦显微镜观察显示：年老组BMMSCs荧光强度明显高于年轻组细胞，提示年老组细胞ROS水平明显高于年轻组。3．RT-PCR检测两种细胞自噬相关基因表达，结果提示：年老小鼠BMMSCsBeclin1、LC3基因表达明显低于年轻组细胞（P＜0.05）；Western Blot检测两种细胞自噬相关蛋白表达，结果提示：年老小鼠BMMSCs Beclin1、LC3II/LC3I蛋白表达明显低于年轻组细胞；激光共聚焦显微镜观察两种细胞LC3荧光强度，结果提示：年老小鼠BMMSCs荧光强度明显低于年轻组细胞；透射电子显微镜观察两种细胞亚显微结构，结果提示：两种细胞内均可观察到典型的自噬体结构，年老组细胞自噬体少于年轻组细胞。4．Western Blot结果显示：100nM雷帕霉素较其他浓度药物刺激能明显提高BMMSCs中Beclin1的表达，为最佳浓度，5mM3-MA较其他浓度药物刺激能明显降低BMMSCs中Beclin1的表达，为最佳浓度；RT-PCR结果显示：雷帕霉素和3-MA均抑制细胞周期相关基因CyclinD1(CCND1)、CyclinD2（CCND2）的表达；RT-PCR结果显示：雷帕霉素对年轻细胞凋亡相关基因Caspase3、Caspase8无明显影响，对年老细胞促进凋亡相关基因Caspase3、Caspase8的表达，而3-MA对年轻、年老细胞均抑制Caspase3、Caspase8的表达。激光共聚焦显微镜观察自噬激活剂和自噬抑制剂对ROS变化实验结果显示：10-4M H2O2刺激年轻组细胞后其荧光强度高于年轻组对照组细胞，说明H2O2能显著提高细胞ROS水平；100nM雷帕霉素+10-4M H2O2组细胞荧光强度低于H2O2刺激组，说明自噬激活能有效降低H2O2刺激引起的ROS水平；100nM雷帕霉素刺激年老组细胞后其荧光强度明显低于年老组对照组细胞，说明激活自噬能有效降低年老细胞ROS水平；5mM3-MA刺激年轻组细胞后，其荧光强度明显高于年轻组对照组细胞，说明抑制自噬能明显提高细胞的ROS水平。【结论】1．衰老BMMSCs出现一系列增龄性变化，表现为增殖能力下降，凋亡水平升高，成骨能力下降，成脂能力升高，乙酰化P53、P21、P16蛋白表达升高，端粒酶活性降低，ROS水平升高。2．衰老BMMSCs的自噬水平较年轻细胞明显降低。3．激活自噬能降低BMMSCs的ROS水平，抑制自噬能提高BMMSCs的ROS水平；调节自噬可影响细胞周期和细胞凋亡。