目的:　　本课题以CRP为靶因子，利用免疫组织化学研究CRP在舌鳞癌组织和细胞中的表达分布情况，并将外源性的重组人CRP与舌鳞癌细胞共培养，采用CCK-8(Cellcounting kit-8)、Transwell小室、划痕实验、AnnexinⅤ-FITC/PI双染、Western Blot及免疫共沉淀等技术研究其对舌鳞癌细胞生长增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学行为的影响及其介导的信号转导通路和分子调节机制，以期为舌鳞癌的临床治疗提供新的治疗思路和实验数据。　　方法:　　本课题分为三部分:　　第一部分:研究CRP在舌鳞状细胞癌组织和细胞中的表达　　实验一:CRP在舌鳞状细胞癌组织中的表达　　收集舌鳞癌组织42例，制作石蜡切片，梯度酒精入水，0.1％胰酶消化液抗原修复，滴加3％双氧水，正常山羊血清封闭，CRP抗体4℃湿盒孵育过夜。滴加生物素化二抗工作液和链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶。DAB显色，苏木素复染，脱水，封片。用Image Pro Plus6.0软件测定累积光密度(IOD SUM)及目标区域面积(area)，计算平均光密度值(mean density)，mean density=(IOD SUM)/area。收集并整理每个患者的临床资料，采用单因素方差分析或t检验进行统计学分析。　　实验二:CRP在舌鳞状细胞癌细胞中的表达　　1.舌鳞癌细胞分泌CRP的研究　　CAL27、SCC4及SCC25细胞常规培养24 h，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测培养基中CRP的含量。　　2.Western blot检测舌鳞癌细胞中CRP的表达　　CAL27、SCC4及SCC25细胞常规培养24h，提取细胞总蛋白，蛋白含量测定，SDS-PAGE电泳，转膜，免疫反应，显影。　　第二部分:研究CRP对舌鳞癌细胞生长增殖、侵袭、迁移和凋亡等生物学行为的作用　　1.CCK-8检测细胞增殖　　在96孔板中加入细胞（CAL27和SCC4细胞）悬液（100μl/孔，细胞密度为3.5×104个/ml），检测CRP效应浓度实验采用含有不同浓度CRP(0、5、10、20、30μg/ml)的DMEM培养细胞24 h。检测CRP作用时间实验采用含有不同浓度（5、10、20μg/ml）CRP的DMEM，分别培养细胞48、36、24、12、6、0h。每孔中加入10μlCCK-8溶液，用酶标仪测定每孔的吸光度值。　　2.Transwell小室检测细胞侵袭　　CAL27细胞在无血清的培养基中饥饿24 h，同化处理。在培养室的上腔分别加入200μl细胞悬液(细胞密度为4×105个/ml)，下腔中分别加入无血清、含10μg/ml CRP及10％ FBS的DMEM各500μl，培养24 h。4％多聚甲醛固定，结晶紫染色，倒置显微镜下计数。　　3.划痕实验检测细胞迁移　　在6孔板中加入CAL27细胞悬液（2 ml/孔，细胞密度为4×105个/ml），待细胞生长融合至90％时，用200μl的枪头在每孔底部划痕。每孔中加入不同条件的培养基（无血清DMEM、无血清DMEM+CRP（10μg/ml）、含有10％ FBSDMEM)，分别在0、6、12、18h时取样，拍照，测量。　　第三部分:研究CRP作用舌鳞癌细胞过程中可能结合的受体及激发的信号调节通路　　实验一:CRP作用舌鳞癌细胞CAL27过程中可能结合的受体　　1.免疫荧光染色检测CAL27细胞表面受体的表达　　细胞爬片，4％多聚甲醛固定，0.2％ TritonⅩ100通透，血清封闭液封闭，滴加一抗（FcγⅠ、FcγⅡ、FcγⅢ）4℃湿盒孵育过夜。暗室中滴加荧光二抗和DAPI，封片，荧光显微镜下观察。　　2.免疫共沉淀检测CRP与CAL27细胞表面受体的结合　　细胞生长融合至100％时，实验组加入CRP(25μg/ml)孵育30 min，对照组中加入PBS。裂解细胞提取蛋白，加入兔来源的CRP抗体后，再加入Agarose A/G进行结合反应，蛋白变性。采用Western blot检测所形成的免疫复合物。　　实验二:CRP作用舌癌细胞CAL27过程中所激发的AKT/mTOR/S6信号通路的研究　　1.Western Blot检测AKT/mTOR/S6信号通路蛋白的表达变化　　在6孔板中加入细胞悬液，待细胞生长融合至70％左右后，采用含有CRP(10μg/ml)的培养基分别培养细胞0、15、30、60、120和0、30、60、120、180、240 min。采用Western Blot检测pAKT、pmTOR、pS6、pNF-κB、pERK蛋白的表达变化。　　2.CCK-8检测在培养基中加入mTOR的抑制剂-雷帕霉素(Rapamyein，RAPA)后细胞的增殖状况　　在96孔板中加入细胞悬液，采用含有不同成分的培养基(DMEM+DMSO，DMEM+CRP, DMEM+CRP+RAPA,DMEM+RAPA)，培养48、36、24、12、6、0h。采用CCK-8检测细胞的增殖状况。雷帕霉素(RAPA)的终浓度为2μm/L。　　实验三:CRP作用舌癌细胞CAL27过程中所激发的Caspase3/9凋亡信号通路的研究　　常规细胞铺板，分别加入含2μg/ml DDP和PBS、含2μg/ml DDP、含2μg/mlDDP和10μg/ml CRP的DMEM，培养CAL27细胞24 h。Western Blot检测Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达变化。　　结果:　　1.CRP在舌鳞癌组织中呈阳性表达，而且舌鳞癌细胞可能产生及分泌CRP　　1.1.CRP在癌旁正常组织中无表达，在舌鳞癌组织中呈阳性表达　　免疫组织化学结果显示，CRP在癌旁正常组织中无表达，在舌鳞癌组织中呈现阳性表达，CRP主要表达于癌细胞的细胞质中。CRP的表达强弱与肿瘤大小、病理分型及有无淋巴结转移有关，而与年龄、性别无关。CRP在中低分化的舌癌组织中表达强于在高分化的舌癌组织中，而且，CRP在有淋巴结转移的舌癌组织中表达更强。　　1.2.舌鳞癌细胞可能产生及分泌CRP　　2.CRP促进舌鳞癌细胞的增殖、侵袭和迁移，降低饥饿和DDP诱导的舌癌细胞的凋亡　　3.CRP可以结合CAL27细胞表面的FcγⅠ受体，上调AKT/mTOR/S6增殖信号通路，下调Caspase-3/9凋亡信号通路　　3.1.CRP可以结合CAL27细胞表面的FcγⅠ受体　　免疫荧光显示CAL27细胞表面表达FcγⅠ、FcγⅡ和FcγⅢ受体。免疫共沉淀显示CRP可以结合FcγⅠ受体形成复合物蛋白沉淀。　　3.2.CRP可以上调AKT/mTOR/S6增殖信号通路　　Western blot结果显示10μg/ml CRP作用CAL27细胞到15、30、60 min时，pAKT和pmTOR表达逐渐升高，pAKT/AKT和pmTOR/mTOR的值逐渐升高，当作用时间延长至120 min时，pAKT和pmTOR表达下调，pAKT/AKT和pmTOR/mTOR的值降低。CRP作用到30 min时，pS6表达上调，pS6/S6的值升高近0.5倍，当作用时间延长至60 min和120 min时，pS6表达减少，pS6/S6的值降低。pNF-κB在CRP作用过程中表达量没有明显变化。在CRP的作用时间从0 min延长至240 min时，pERK/ERK逐渐降低。在培养基中加入雷帕霉素后，CCK-8结果显示细胞的增殖明显低于只加入CRP组。Western Blot结果显示加入雷帕霉素组，PCNA蛋白的表达量明显低于CRP组。　　3.3.CRP可以下调Caspase-3/9凋亡信号通路　　Western Blot结果显示加入CRP培养24 h后， Cleaved Caspase-3蛋白的表达减少，Cleaved PARP和Cleaved Caspase-9蛋白的表达也减少。　　结论:　　1.CRP可能在舌鳞癌的发生发展中起了重要的促进作用。　　2.CRP能促进舌鳞癌细胞的增殖、侵袭和迁移，降低饥饿和DDP诱导的舌癌细胞的凋亡率。　　3.CRP可能通过结合舌癌细胞表面的FcγⅠ受体来影响舌癌细胞的生物学行为。　　4.CRP可能通过AKT/mTOR/S6信号通路促进舌癌细胞CAL27的增殖，从而影响肿瘤的发生发展。　　5.CRP可能通过减少Caspase-3/9蛋白的活化降低DDP诱导的CAL27细胞的凋亡率。