【摘 要】
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CRISPR/Cas9是新近开发的一种基因编辑技术,由两部分组成,非特性的核酸酶Cas9蛋白和一个小片段导向RNA。鉴于CRISPR/Cas9系统结构简单,容易操作以及较高的基因组切割效率,已
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CRISPR/Cas9是新近开发的一种基因编辑技术,由两部分组成,非特性的核酸酶Cas9蛋白和一个小片段导向RNA。鉴于CRISPR/Cas9系统结构简单,容易操作以及较高的基因组切割效率,已经被广泛应用于各种生物的基因组编辑研究中。Cas9核酸酶在导向RNA的引导下,能够特异性的结合到基因组的靶位点,并在PAM序列的配合下,对靶位点进行双链切割。解析Cas9蛋白中DNA结合域对改进Cas9核酸酶活性以及开发新的基因编辑系统具有重要的意义。本研究首先将非特异性核酸酶Fok1与Cas9基因进行融合,然后对Cas9基因从两端进行截短突变,结合双荧光报告载体系统,在293T细胞中对相关突变体进行功能验证。以期发现Cas9蛋白中DNA的结合功能域。同时针对CRPISPR/Cas9系统中sgRNA的表达,在前期研究的基础上进一步提出了Cys4介导的sgRNA-shRNA阵列表达策略,期望改进和提高本实验室所开发的多重sgRNA及shRNA阵列表达技术。首先,设计了8个不同长度截短的Cas9基因突变体,并将这些突变体以及全长Cas9分别与FokI融合构建了相应的sgRNA/Cas9-FokI表达载体。鉴于FokI需要形成二聚体才具有切割活性,为了验证分析不同sgRNA/Cas9-FokI的功能,进一步构建了含有双sgRNA靶序列(均含有/不含PAM位点)的SSA-DsRed/eGFP双荧光报告载体。将9种不同的sgRNA/Cas9-FokI表达载体分别与靶序列含PAM或不含PAM的SSA-DsRed/eGFP双荧光报告载体共转染293T细胞,通过荧光观察和流式细胞仪计数分析可以评估不同sgRNA/Cas9-FokI的活性,进而分析确定Cas9蛋白的DNA结合域以及其对靶序列PAM的依赖性。在初步的sgRNA/Cas9-FokI活性验证实验中,发现全长Cas9实验组仍具有活性,但是仅局限于靶序列含PAM的报告载体;而两端截短Cas9的实验组均不具备活性,说明Cas9蛋白两端区域均影响sgRNA/Cas9复合体对靶序列的识别作用,同时PAM也是该识别作用所必须的。其次,以Csy4识别序列为间隔设计并构建了新型的sgRNA-shRNA/Cas9表达载体VLC-Csy4/Cas9(含VEGF.sgRNA、LIG4.shRNA和CCR5.sgRNA)及对照载体VCC-Csy4/Cas9(含VEGF.sgRNA、对照CON.shRNA和CCR5.sgRNA)。结合实验室现有的针对VEGF.sg RNA和CCR5.sgRNA的SSA-DsRed/eGFP双荧光报告载体,通过细胞转染实验,初步证明VLC-Csy4/Cas9中表达的sgRNAs均具有较高的活性。进一步通过qRT-PCR实验对VLC-Csy4/Cas9中表达的LIG4.shRNA进行活性鉴定,结果表明LIG4基因的表达量与VCC-Csy4/Cas9对照组相比被敲低40%以上,比实验室前期开发的基于Drosha的sgRNA-shRNA系统有了显著性提高。初步证明了Csy4介导的sgRNA-shRNA阵列表达技术的可行性,为以后进一步的优化和应用研究奠定了基础。
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