【摘 要】
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腺病毒作为一种优秀的抗原递送工具,目前已广泛用于载体疫苗研究。虽然以HAd V-5为代表的腺病毒载体应用于动物疫苗领域具有高安全性、高免疫原性、高病毒产量和高稳定性等诸多优势,但是载体自身免疫和缺乏免疫细胞靶向性是影响腺病毒载体疫苗免疫效果的两大主要因素。本论文主要针对腺病毒受体种类很多,尤其是DC细胞靶向性的缺陷,通过噬菌体十二肽库筛选猪DC细胞受体（CD205、CD209）靶向肽,并尝试将筛选
【基金项目】
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十三五重点研发项目基金（编号:2016YFD0500306）；
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腺病毒作为一种优秀的抗原递送工具,目前已广泛用于载体疫苗研究。虽然以HAd V-5为代表的腺病毒载体应用于动物疫苗领域具有高安全性、高免疫原性、高病毒产量和高稳定性等诸多优势,但是载体自身免疫和缺乏免疫细胞靶向性是影响腺病毒载体疫苗免疫效果的两大主要因素。本论文主要针对腺病毒受体种类很多,尤其是DC细胞靶向性的缺陷,通过噬菌体十二肽库筛选猪DC细胞受体（CD205、CD209）靶向肽,并尝试将筛选的猪DC细胞受体靶向肽与腺病毒p IX融合表达,构建猪DC细胞靶向重组人腺病毒载体,以期提高腺病毒载体疫苗的安全性和有效性。本研究由以下三部分内容组成:1.DC细胞表面受体CD205、CD209胞外区的克隆表达首先合成CD205整个胞外区的第5段C型识别域（CRD-5）和CD209（DC-SIGN）的完整胞外区核苷酸序列。PCR扩增CD205的第5段CRD片断和CD209完整CRD片断,将这2个片断分别连接到p ET32a载体上,构建了载体p ET32a-CD205-5、p ET32a-CD209表达载体。通过IPTG诱导后SDS-PAGE、镍柱纯化和Western blot试验证明融合蛋白Trx-CD205-5、Trx-CD209和Trx（p ET32a空载表达）得到正确表达和高效纯化。2.CD205、CD209胞外区的靶向肽筛选及鉴定以融合蛋白CD205、CD209为诱饵,对噬菌体随机十二肽库进行淘选,扣除仅与Trx标签蛋白结合的噬菌体单克隆后,进一步通过噬菌体ELISA实验、DC细胞免疫荧光实验和流式细胞检测实验对噬菌体淘选得到的高结合短肽进行特异性鉴定。确定筛选到了DC受体CD209靶向肽,命名CD209A/CD209B/CD209C。3.表达DC靶向肽重组人腺病毒的构建及鉴定通过PCR从pFPAV3-SRBD上扩增PEDV的S蛋白RBD抗原,携带同源臂,与PH5L骨架进行同源重组,构建载体p H5L-SRBD。在p H5L-SRBD基础上,将从噬菌体库筛选出的特异性短肽CD209A/CD209B/CD209C克隆到p H5L-SRBD载体中p IX的C末端,并与p IX融合表达,构建双表达SRBD和p IX/CD209s的穿梭质粒p H5L-SRBD-p IX/CD209s。载体p H5L-SRBD和靶向载体p H5L-SRBD-p IX/CD209s分别与基因组骨架载体p H5R共同转染293A细胞进行病毒包装。包装后的重组人腺病毒分别命名为HAd V5-SRBD（对照）、HAd V5-SRBD-p IX/CD209B和HAd V5-SRBD-p IX/CD209C。PCR、Western blot和荧光定量实验证明靶向重组病毒构建成功。后续拟进一步验证DC靶向肽在腺病毒表面的展示,验证具有DC靶向肽的腺病毒的DC靶向性。并以SRBD为抗原,验证筛选到的DC靶向肽是否可提高人腺病毒载体疫苗在猪上的免疫效果,为后期开发基于人腺病毒的高效猪用载体疫苗奠定基础。
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