【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）诱发的传染病,引起母猪流产、仔猪呼吸障碍和严重的免疫抑制反应。该病毒在全球猪群中广泛传播,大规模的疫苗免疫仍然未能消除其流行,该病
【基金项目】
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科技部十三五国家重点研发计划（编号:2017YFD0501004）；
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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）诱发的传染病,引起母猪流产、仔猪呼吸障碍和严重的免疫抑制反应。该病毒在全球猪群中广泛传播,大规模的疫苗免疫仍然未能消除其流行,该病在世界各国的生猪养殖业中都导致了极大的经济损失,是全球养猪业中难以控制的主要疫病之一。本实验室在前期的研究中已获得针对PRRSV的两株鼠源单抗。本研究拟验证其对PRRSV不同毒株具有广谱反应性及中和活性,并对这两株单克隆抗体的杂交瘤细胞中抗体轻链和重链可变区扩增后进行编码基因的测序,再通过恒定区替换的方式开发出针对PRRSV宿主源的嵌合型基因工程单克隆抗体,并对其生物学功能进行初步鉴定。本研究的工作和结果如下:1.Mab-M和Mab-GP3抗体的纯化及反应性测定采取体内制备法将分泌Mab-M和Mab-GP3单克隆抗体的杂交瘤细胞注入BALB/c小鼠腹腔中制备腹水,采取硫酸铵沉淀法以及Protein G Resin层析从腹水中纯化得到高纯度单克隆抗体,并经SDS-PAGE验证。之后测定抗体亚型,并利用IFA试验,使Marc-145细胞感染PRRSV 1和2型不同毒株,证明感染后的细胞均可以被这两株抗体所识别。从而验证两株单克隆抗体对PRRSV广谱识别和反应性。2.Mab-M和Mab-GP3对PRRSV病毒具有广谱中和活性用不同浓度的两株抗体分别与病毒37℃孵育1 h后感染PAM细胞1h后换新培养液培养36h,之后收取细胞裂解物进行Western blot和q PCR试验,证明这两株单克隆抗体可以中和病毒从而抑制PRRSV在细胞内的增殖,同时检测相对应的细胞培养上清中的病毒滴度,病毒滴度呈梯度下降进一步说明了抗体对病毒的中和作用。通过细胞感染PRRSV-1型病毒GZ11和PRRSV-2型病毒VR2332,JXA1,GD-HD,Mab-M和Mab-GP3均可以抑制不同型病毒的复制,说明其具有广谱中和活性。3.针对PRRSV的嵌合抗体的制备根据所得的两株单克隆抗体Mab-M和Mab-GP3,提取杂交瘤细胞的总RNA并扩增鼠单抗重链和轻链的可变区进行测序分析,之后先选取Mab-GP3,通过将该抗体重链轻链可变区和猪源抗体重链轻链恒定区相连接并克隆进行嵌合抗体的合成,并将合成后的嵌合抗体通过间接免疫荧光的方法检测到其仍可以与感染了PRRSV后的Marc-145细胞发生特异结合,从而验证其仍保留亲本抗体与PRRSV病毒的特异性结合力。综上所述,本研究证明了Mab-M和Mab-GP3对PRRSV病毒具有广谱的中和活性,能抑制不同基因型的毒株在PAMs细胞中的复制增殖,并测序两株单抗的重链轻链可变区序列,试制备嵌合抗体Mab-GP3。该研究结果发现了对PRRSV有广谱中和活性的单克隆抗体,同时试制备了鼠猪嵌合抗体,为PRRSV抗病毒治疗提供了新的方向。
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