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1.实验性精索静脉曲张对大鼠睾丸内锚定连接的损伤作用精索静脉曲张是一种常见的雄性生殖系统疾病,是目前公认的造成男性不育的主要原因,然而该疾病的病理学机制仍不明确而且存在争议。睾丸内的锚定连接存在于支持细胞与生殖细胞之间或者支持细胞与支持细胞之间,锚定连接结构和功能的正常对于精子的正常发生与形成起到至关重要的作用。本实验通过建立实验性静脉曲张大鼠模型,探讨8周及12周实验性精索静脉曲张对大鼠睾丸内支持细胞与生殖细胞之间锚定连接的损伤作用及可能的机制。实验采用60只雄性SD大鼠(200±20g)随机分为假手术组8周、假手术组12周、VC模型组8周、VC模型组12周,每组15只。观察左侧睾丸形态学、锚定连接超微结构、细胞周期、锚定连接结构蛋白表达以及锚定连接动力学调控相关信号分子表达。实验结果显示,实验性精索静脉曲张会引起未成熟生殖细胞脱落、锚定连接损伤、精子头部朝向混乱、细胞周期紊乱、锚定连接结构蛋白及细胞骨架蛋白表达降低、p-FAK-Tyr397水平升高、其重要的下游信号分子p-Src-Tyr416水平升高以及ERK1信号通路的激活。我们得到的结论是实验性精索静脉曲张会引起锚定连接损伤,p-FAK-Tyr397水平的升高可能与锚定连接的损伤有关,并通过激活ERK1信号通路破坏肌动蛋白骨架网络。该实验内容对于了解精索静脉曲张引起男性不育的病理机制及寻找该疾病新的治疗靶点都有积极意义。2.巴戟天多糖对实验性精索静脉曲张大鼠生殖系统的修复作用巴戟天为天然中草药,在中医临床上,巴戟天被用于补肾壮阳已有非常悠久的历史。精索静脉曲张是造成男性不育的主要原因,但是其发病机制及造成男性不育的原因一直存在争议。本部分实验通过建立实验性静脉曲张大鼠模型,探讨巴戟天多糖对实验精索静脉曲张大鼠生殖系统的修复作用。75只健康雄性SD大鼠(200±20g)随机分假手术组、VC+生理盐水组、VC+200mgkg-1、300mgkg-1、400mg kg-1巴戟天多糖给药组五组,每组15只。观察左侧睾丸形态学、紧密连接超微结构,检测紧密连接蛋白的表达、性激素水平、细胞因子水平及抗精子抗体水平。实验结果显示,精索静脉曲张会引起生精上皮及紧密连接的破坏,并引起左侧附睾精子数量减少,睾酮水平降低,血清性激素水平紊乱,左侧睾丸内细胞因子TGF-β3和TNF-α水平升高,减少紧密连接蛋白水平,增加血清抗精子抗体水平。巴戟天多糖能修复损伤的生精上皮及紧密连接,减少生殖细胞凋亡,调节紊乱的激素水平趋于正常,减少血清抗精子抗体水平,增加紧密连接蛋白表达水平。该部分实验得到的结论是巴戟天多糖能促进生精功能,能减轻实验性精索静脉曲张对生精上皮及紧密连接的损伤作用,并且可能是通过降低左侧睾丸内细胞因子TGF-β3和TNF-α水平及调节紊乱的激素水平实现的。巴戟天多糖是一个非常有潜力的中药成分,可用于临床上常见的精索静脉曲张疾病的治疗或辅助治疗。3.实验性精索静脉曲张大鼠左侧睾丸microRNA测序及miR-181d-5p通过PTEN调控TM4细胞间紧密连接microRNA是一类单链小分子RNA,可以通过诱导mRNA的切割降解、翻译抑制或者其他形式的调节机制抑制靶基因的表达,近年来研究发现miRNA参与多种生物学过程,并且与疾病的发生和发展密切相关。本实验通过miRNA测序筛选出实验性精索静脉曲张引起的左侧睾丸内差异表达的miRNA,并验证miRNA-181d-5p 与 PTEN3’UTR相互作用,在 TM4 细胞上验证 miRNA-181d-5p 对细胞间TJ的影响并探讨可能的机制。实验采用16只雄性SD大鼠(200±20g)随机分为假手术组和实验性精索静脉曲张模型组,通过miRNA测序筛选差异表达miRNA,并进行PCR验证。通过网站预测miRNA的靶基因,并用双荧光素酶报告基因分析实验在293T细胞上进行验证,之后在TM4细胞上采用mimics过表达miRNA,测定TER来确定miRNA的功能。miRNA测序结果及PCR验证筛选出差异表达miRNA-181d-5p,并验证其能与PTEN的3’UTR区结合,降低PTEN蛋白水平。在TM4细胞上过表达miRNA-181d-5p,发现其能降低TM4细胞间跨膜电阻值(TER),降低PTEN蛋白水平,升高p-FAK-Tyr397水平。最终得到的结论是miRNA-181d-5p可以与PTEN 3’UTR区结合,降低PTEN蛋白水平。miRNA过表达会引起TM4细胞间TJ开放,跨膜电阻值降低,其机制可能是高水平的miRNA-181 d-5p会引起PTEN蛋白水平的降低,继而引起p-FAK-Tyr397水平升高和PI3K/Akt信号通路的激活,引起细胞间TJ开放。4.300mg kg-1巴戟天多糖对实验性精索静脉曲张大鼠睾丸修复作用的蛋白质组学研究蛋白质组学是近年发展起来的一门新兴学科及研究领域,它是指从机体或细胞的整体蛋白质水平阐述生命活动规律。本实验通过TMT法对大鼠左侧睾丸组织进行蛋白质组学分析,筛选实验性精索静脉曲张手术后和给予巴戟天多糖后差异表达蛋白,并对差异表达蛋白进行生物信息学分析。采用红外光谱(IR)、1H-NMR核磁共振及高效凝胶柱法(GPC)对巴戟天多糖进行化学指纹图谱分析。18只健康雄性SD大鼠(200±20g)随机分为假手术、VC模型组、VC+300mg kg-1巴戟天多糖给药组。通过TMT法筛选左侧睾丸组织内差异表达蛋白,并对差异表达蛋白进行GO和KEGG通路富集分析。TMT蛋白质组学分析结果显示,测定的多肽总数为14742,蛋白总数为2510,可定量蛋白总数2412,三组间总差异蛋白数为57。其中VC模型组和假手术组相比差异蛋白总数为46个,VC+300mg kg-1巴戟天多糖给药组与VC模型组相比差异蛋白总数为21个,VC+300mg kg-1巴戟天多糖给药组与假手术相比差异蛋白总数为5个。对三组间差异表达蛋白进行层次聚类分析发现,VC+300mg kg-1巴戟天多糖给药组与假手术之间蛋白表达相似,而VC模型组与其他两个组差异较大。GO和KEGG通路富集分析显示,差异蛋白主要富集于核糖体、线粒体功能、体温调节、细胞凋亡信号通路、糖类物质代谢、氧化应激反应、激素水平调节、血液循环等生物过程。因此我们认为巴戟天多糖能使由VC引起的组间差异表达蛋白数量减少,使给药组和正常组之间蛋白质组成相似,蛋白质表达水平接近。此种作用可能与核糖体蛋白质合成、线粒体功能、糖类物质代谢、氧化应激反应、激素水平调节、血液循环等生物学过程相关。