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米尔贝霉素A3/A4及其衍生物作为环境友好型杀螨剂、驱虫剂被应用于农业和畜牧业中。冰城链霉菌是重要的米尔贝霉素A3/A4工业生产菌株,具有丰富的次级代谢物产生能力。在其发酵培养过程中,除米尔贝霉素A3/A4外,常伴随产生其它米尔贝霉素组分、南昌霉素、冰城霉素等多种次级代谢产物。米尔贝霉素B1、B2、α9、α10、β1、β2及其它β类米尔贝霉素组分由于在化学结构和性质上与米尔贝霉素A3/A4相似,无法通过理化性质差异分离,增加了米尔贝霉素A3/A4的分离纯化难度。米尔贝霉素类副产物的生成竞争了米尔贝霉素A3/A4的合成前体,降低了米尔贝霉素A3/A4的单位发酵产量,导致米尔贝霉素A3/A4生产成本难以降低从而限制其广泛应用。本课题组在前期研究中利用物理、化学诱变以及系列代谢工程改造等方法获得了米尔贝霉素B1、B2、β1、β2等副产物消除的优良菌株,但是米尔贝霉素α9/α10和β类米尔贝霉素副产物仍伴随米尔贝霉素A3/A4产生。为了阻断或降低副产物米尔贝霉素α9/α10和β类米尔贝霉素的生物合成,进一步优化米尔贝霉素A3/A4生产菌株,本研究探索了参与米尔贝霉素α9/α10和β类米尔贝霉素生物合成过程中的后修饰酶。cyp41（sbi07711）编码一种细胞色素P450（CYP450）酶。Cyp41是Nelson细菌CYP450数据库中收录的唯一一个发现于链霉菌属CYP268家族的蛋白。通过对cyp41基因进行体内敲除、回补和异源表达及体外投喂试验证明,Cyp41能够催化米尔贝霉素A3/A4的C26位发生羟基化,生成米尔贝霉素α9和α10的生物合成前体α26和α27。在冰城链霉菌BC04中敲除cyp41后得到突变株B4DP,发酵培养后经HPLC检测发现米尔贝霉素α9/α10组分不再生成,同时米尔贝霉素A3/A4产量从2382.5 mg/L提高到2625.6 mg/L。此外,本研究对属于CYP171家族的蛋白MilE进行了研究,通过体内敲除及回补和异源表达及体外投喂试验证明MilE负责米尔贝霉素C6-C8间呋喃环的形成,催化β类米尔贝霉素生成α类米尔贝霉素。在冰城链霉菌B4DP中过表达milE得到突变株BPSE,与出发菌株相比,突变株BPSE中β类米尔贝霉素含量降低约77.2%,米尔贝霉素A3/A4产量提高约39.0%。对突变株BPSE进行qRT-PCR检测发现米尔贝霉素生物合成关键基因的转录水平均有所升高。同时对负责米尔贝霉素类化合物螺酮环形成的后修饰酶MilC进行初步研究,在BC04中过表达milC后突变株中米尔贝霉素A3/A4单位发酵产量提高约13.5%。基于上述研究结果,最后我们对高产菌株BC04进行了基因工程改造,获得了优良菌株BPSEC,与出发菌株BC04相比,其米尔贝霉素A3/A4产量提高约57.69%,达到3727.21 mg/L。综上,本研究取得了以下成果:（1）首次发现并鉴定了负责米尔贝霉素A3/A4的C26位羟基化的CYP450酶;（2）首次发现过表达milE可提高米尔贝霉素生物合成基因簇内关键基因的转录水平;（3）获得了一株不产米尔贝霉素α9/α10、低产β类米尔贝霉素而高产米尔贝霉素A3/A4的菌株BPSEC;（4）提出通过基因工程改造多个后修饰酶来提高米尔贝霉素A3/A4产量并减少副产物的策略。