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苯乙烯,英文名称styrene,是塑胶行业的重要原料。作业环境中的苯乙烯主要以气体形式通过呼吸道进入人体。研究表明,短期接触可刺激皮肤和呼吸道,长期接触可以抑制中枢神经系统,在啮齿类动物中长期接触还可引起蛋白质和核酸的加合作用,但是在人体中的遗传毒害还有待证实。近年来的研究已经基本确立了苯乙烯在人和啮齿类动物中的代谢途径。它的代谢具有较大的物种特异性。在苯乙烯的体内代谢物中有三种物质苯乙烯环氧化物(SO),苯乙二醇(SG)和扁桃酸(MA)属于手性化合物。由于SO是引起机体遗传伤害的主要因素,有报道指出它的两个对映体具有不同程度的毒害作用,所以有关苯乙烯立体选择性代谢成SO以及SO的代谢已进行了广泛研究。但关于SG和MA立体选择性代谢报道很少。因此本文较系统地研究了SG和MA的立体选择性代谢机制,这有助于深入了解苯乙烯的毒物代谢学和毒理学,并对职业病中苯乙烯的预防控制有重要意义。
主要内容包括了以下四个方面:
一、苯乙烯代谢物在大鼠尿中排泄的立体选择性研究
以S-α-(1-萘基)-乙胺(S-NEA)为手性衍生化试剂,1-羟基-苯并-三氮唑(HOBT)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基-碳酰亚胺(EDC)为偶联剂,建立了柱前衍生化RP-HPLC法同时分析MA对映体和苯乙醛酸(PGA),考察了衍生化试剂用量和反应时间对于反应的影响,优化了衍生化反应条件。该方法在5～250μg·mL-1浓度范围内线性关系良好,提取回收率大于90％,日内精密度和日间精密度均小于10%,本方法的检测限和定量限分别为1μg·mL-1和5±0.4μg·mL-1,可用于大鼠尿中MA对映体和PGA的定量分析研究。
12只雄性SD大鼠被随机分为三个试验组,分别以10,50和100mg·kg-1剂量口服苯乙烯(溶解于茶油中)。收集24h尿样,采用柱前衍生化RP-HPLC法测定MA对映体和PGA的浓度。以100mg·kg-1剂量给药来考察不同时间尿中代谢物MA和PGA的排泄过程。结果表明SD大鼠口服苯乙烯后,尿中代谢物主要为R-MA和PGA,未检测到S-MA。0～48h尿中R-MA的排泄量占口服剂量平均百分比为28.2%,最大排泄速率为0.57μg·h-1;0～48h尿中PGA的排泄量占口服剂量平均百分比为20.7%,最大排泄速率为0.23μg·h-1。该结果与报道的Wistar大鼠结果进行了比较,表明苯乙烯的代谢在大鼠中存在一定的品系差异。
二、SD大鼠体内苯乙二醇和扁桃酸的立体选择性排泄研究
采用SD大鼠口服SG或MA单个对映体实验,研究了SG和MA尿中排泄的立体选择性。实验结果表明SD大鼠口服S-MA后,体内发生明显的S-MA向R型的转化;同时还发现大鼠口服S-MA后尿中产生的PGA要比口服R-MA组显著的多。SG的体内实验结果表明,大鼠口服S-SG后,尿中出现较多的PGA,并且有R-MA出现;而R-SG口服后未发现S-MA,PGA生成量也较少。另外SG组尿中均未检测到马尿酸(HA)。该结果与报道的Wistar大鼠结果进行了比较,表明SG和MA的代谢在大鼠中存在一定的品系差异。
三、苯乙二醇和扁桃酸体外代谢的立体选择性研究
采用SD大鼠肝微粒体、组织S9和原代培养的大鼠肝细胞以及体外肝细胞悬液体系,研究了SG和MA在大鼠中的体外立体选择性代谢,并利用ICR小鼠和中国家兔S9系统考察了这两种化合物的立体选择性代谢的物种差异。最后还采用几种乙醇脱氢酶抑制剂如重金属离子(铜离子和镉离子)以及乙醇和4.甲基吡唑,考察它们对于SD大鼠S9酶代谢的抑制作用。结果表明:在原代培养的肝细胞体系中,MA的两个对映体都可以代谢为PGA,但S型生成的代谢物PGA要比R型多;R-SG倾向于代谢为HA,而S-SG则倾向于生成PGA。在体外肝细胞悬液体系中,SG和R-MA未发生代谢,而S-MA可被代谢成PGA。MA和PGA在大鼠肝微粒体中未发生葡糖醛酸结合反应。S-MA在大鼠肝和肾S9中可被快速代谢为PGA,而R-MA和SG无代谢。两种化合物在小鼠各组织S9和兔子S9中均无代谢。测定了S-MA在大鼠肝和肾中的酶代谢动力学常数。S-MA在大鼠肝和肾中的代谢酶的Vmax分别为1.4±1.1和12.7±4.3μmol·g-1·min-1(n=3),Km分别为314.7±121.2和279.5±111.2μmol·L-1(n=3),清除率分别为0.004±0.002和0.047±0.005L·min-1·g-1(n=3)。重金属硫酸铜和氯化镉可以抑制代谢,硫酸铜对于肝酶和肾酶Ki值分别为549.7±57.4和384.5±8.4μmol·L-1,氯化镉对于肝酶和肾酶的Ki值分别为676.4±8.2和452.2±22.2μmol·L-1。而乙醇和4-甲基吡唑在很大范围内不影响代谢。
四、扁桃酸手性转化机制的研究
运用各种体外系统来研究MA的体外手性转化情况,试图阐明MA在大鼠中的手性转化机制。采用的体外系统有:(1)非酶体系,主要考察了pH值为1.5和7.4的磷酸盐缓冲液;(2)SD大鼠肠道菌群共培养;(3)SD大鼠组织匀浆(包括胃、肠、肺、肝和肾)孵育;(4)人HepG2细胞培养;(5)体外肝细胞孵育。实验结果表明MA单个对映体在非酶体系中稳定,在肠道菌丛培养及胃、肠、肺匀浆中稳定,在肝和肾匀浆中S-MA可被代谢为PGA,但不发生手性转化。在HepG2细胞中无转化发生。而在体外细胞孵育中S-MA被同时转化成R-MA和代谢为PGA。可能的手性转化机制为SD大鼠肝中具有类似细菌的MA消旋化酶活性的酶。