论文部分内容阅读
目的：为探讨转录因子Hlx在树突状细胞中的作用，我们了构建携带小鼠Hlx基因的真核表达质粒pIRES2-mHlx-EGFP，转染鼠树突状细胞系，建立稳定过表达转录因子Hlx的小鼠DC2.4细胞株，通过一系列体外实验研究过表达转录因子Hlx的树突状细胞株在生物学行为和功能的改变，作为一种工具细胞株为进一步的研究奠定基础。
方法：
(1)采用PCR方法，以Hlx含有基因的PGEM-T质粒为模板扩增mHlx基因，将mHlx基因克隆至pIRES2-EGFP真核载体，通过PCR，双酶切筛选阳性克隆并进行序列测定。
(2)将测序正确的pIRES2-mHlx-EGFP载体应用脂质体的方法(质粒(μg)∶脂质体(1μl)=1:3)转染DC2.4细胞，转染的细胞通过600μg/ml G418筛选和EGFP的表达，并经过单克隆化生长，获得稳定表达EGFP的抗性DC2.4细胞株。再应用RT-PCR、Western-blot筛选出高表达Hlx的克隆株。
(3)应用real-time PCR的方法在转录水平比较不同细胞株DC2.4、DC2.4/EGFP、DC2.4/Hlx中的T-bet、GA TA3、Ifn-γ、Il-4、Il-12p40、Il-12p35、Il-6的表达变化；再应用ELISA的方法在蛋白水平对不同细胞株培养上清中细胞因子IFN-γ和IL-12P70进行检测。
(4)应用PE标记的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD40、CD80、CD86、TLR4、CCR7单克隆抗体(5μg/ml)对不同细胞株进行染色，再应用FACS分析表面分子的变化。
(5)DC2.4、DC2.4/EGFP和DC2.4/Hlx分别和表达红色荧光蛋白HcRed并且应用3％多聚甲醛固定处死的大肠埃希菌37℃共培养2h，同时在4℃做平行对照作为背景扣除非特异性吸附和设定LPS刺激组作为阳性对照，FACS分析过表达转录因子Hlx对树突状细胞吞噬的影响。
(6)抗原提呈功能分析：DC2.4、DC2.4/EGFP、DC2.4/Hlx用100mg/L的OVA刺激24h，然后30 mg/L丝裂霉素37℃处理20分钟，预冷的PBS洗涤两次备用。无菌分离预先应用OVA免疫过的C57BL/6小鼠脾脏，应用MACS分离CD4+T细胞，3 mmol/L CFSE染色后备用。于24孔板一个培养孔中接种2×106个CFSE标记的CD4+T细胞和2×105个树突状细咆共培养三天后FACScalibur分析CD4+T细胞分裂；另外于96孔板中每孔接种2×105个未标记CD4+T细胞和2×104个树突状细胞共培养，三天后MTT法检测增殖。两组中均设空白和阳性对照。
结果：
(1)成功构建真核表达载体PIRES2-mHlx-EGFP，经PCR，双酶切鉴定均与目的片段大小相符；序列测定结果显示与GenBank中(NM008250.1)鼠Hlx基因序列完全一致。
(2)PIRES2-mHlx-EGFP和PIRES2-EGFP分别转染树突状细胞株DC2.4经G418抗性筛选得到抗性细胞株，经FACS，RT-PCR，Western-blot鉴定成功建立DC2.4/mHlx，DC2.4/EGFP细胞株。
(3)RT-PCR检测显示过表达Hlx的DC2.4/Hlx和DC2.4/EGFP、DC2.4相比，Ifn-γ、Il-12p35、Il-12p40、Il-6转录均增加，而转录因子T-bet和GATA3无明显差异；Il-4无表达。ELISA结果表明，细胞培养上清中细胞因子IFN-γ和IL-12p70分泌增加。
(4)表面分子分析显示过表达Hlx的DC2.4相较于DC2.4/EGFP，DC2.4表面分子MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，共刺激分子CD80、CD86、CD40表达均增加，而TLR4表达水平很低且差别不明显，CCR7无表达。
(5)吞噬能力分析表明，与正常DC2.4比较：DC2.4/Hlx细胞吞噬能力明显下降，DC2.4/EGFP细胞吞噬能力也稍有减弱，而LPS刺激组则无十分明显改变。抗原提呈能力分析显示，DC2.4/Hlx可以更有效地提呈抗原给T细胞，促进CD4+T细胞的增殖。
结论：
(1)成功构建真核表达载体PIRES2-mHlx-EGFP。
(2)建立过表达鼠HLx基因树突状细胞系DC2.4/mHlx和对照细胞系DC2.4/EGFP。
(3)功能研究发现，在未成熟树突状细胞系DC2.4中过表达转录因子Hlx，可以促进IFN-γ的转录和表达，进而促使树突状细胞成熟，IL-12分泌增加，吞噬能力下降、抗原提呈能力增强，能够更有效的促进同基因型来源的CD4+T细胞的分裂增殖。