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目的1观察扶肾颗粒对尿素诱导的人结肠上皮细胞损伤的干预作用。2研究扶肾颗粒对CKD大鼠肠道屏障损伤的影响。3探讨扶肾颗粒干预尿毒素诱导的肠道屏障损伤的作用机制。方法1建立尿素处理人结肠上皮T84细胞的离体实验模型。(1)MTT法检测尿素及扶肾颗粒含药血清对T84细胞增殖的影响。(2)培养人结肠上皮T84细胞,选用0mg/dl、72mg/dl、144mg/dl尿素处理T84细胞24h、48h模拟肠上皮屏障损伤,Western Blot法检测紧密连接蛋白闭合小环蛋白1(ZO1)、闭合蛋白-1(Claudin-1)相对表达水平,以评估肠上皮损伤程度,选取最佳造模浓度;并将实验分为空白组、模型组、低剂量扶肾颗粒含药血清组、高剂量扶肾颗粒含药血清组及PDTC组。(3)免疫荧光染色法检测药物作用前后肠上皮紧密连接Claudin-1的荧光表达水平。(4)Western Blot法检测ZO1、Claudin-1、核转录因子-κB P65、磷酸化P65(p-P65)、IκBα及磷酸化IκBα(p-IκBα)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、丙二醛(MDA)、细胞间黏附因子-1(ICAM-1)、趋化因子配体-2(CXCL2)、L-选择素(CD62L)、环氧化酶(COX2)表达水平。(5)实时荧光定量PCR试验(q RT-PCR)检测ZO1、Claudin-1、核因子E2相关因子2(Nrf2)、白介素6(IL6)、ICAM-1、CD62L和CXCL2 m RNA表达水平。2 5/6肾切除手术制备在体CKD大鼠模型。(1)选用雄性SD健康大鼠60只,随机将大鼠分成两个部分为假手术组(C组)12只和造模组48只,造模组采用5/6肾切除法制作CKD大鼠模型,7天后,将造模组的大鼠随机分为模型组、低剂量扶肾颗粒干预组、高剂量扶肾颗粒干预组、NF-κB抑制剂组,每组各15只,各治疗组分别给予相应药物干预,连续灌胃6周。实验全程普通饲料喂养,自由进水。第6周末杀检,收集肠、肾组织以备后续检测。(2)生化法检测大鼠的Scr、BUN;高效液相色谱法检测肠源性毒素IS、PCS含量。(3)HE染色法观察肾、结肠的病理改变。(4)免疫组化法(IHC)观察结肠组织ZO1、Claudin-1在肠道的表达情况。(5)Western Blot法检测结肠组织ZO1、Claudin-1及环氧化酶-2(COX2)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、趋化因子配体-2(CXCL2)、L-选择素(CD62L)蛋白表达水平。结果1细胞实验结果:(1)不同浓度的尿素及扶肾颗粒含药血清干预细胞后的吸光度无统计学差异(P>0.05)。(2)Western blot结果显示,不同浓度尿素可不同程度的降低ZO1、Claudin-1蛋白的表达水平(P<0.01或P<0.05),其中144mg/dl尿素处理T84细胞48h后的模型最佳。(3)免疫荧光检测显示,与空白组相比,Claudin-1荧光表达降低;与模型组相比,各治疗组Claudin-1荧光表达升高。(4)Western blot结果显示,与空白组相比,模型组ZO1、Claudin-1蛋白表达水平显著降低(P<0.01);p-P65/P65、p-IκBα/IκBα、TNFα、CXCL2、ICAM-1、CD62L、COX2、MDA蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组相比,各治疗组ZO1、Claudin-1蛋白表达水平显著升高(P<0.01),p-IκBα/IκBα、p-P65/P65、TNFα、CXCL2、ICAM-1、CD62L、COX2、MDA蛋白表达水平均有不同程度降低(P<0.01或P<0.05)。(5)实时荧光定量PCR试验显示,与空白组相比,ZO1、Claudin-1及Nrf2m RNA表达水平显著下降(P<0.01);IL6、ICAM-1、CD62L和CXCL2 m RNA表达水平均有不同程度升高(P<0.01或P<0.05);与模型组相比,各治疗组ZO1、Claudin-1及Nrf2 m RNA表达水平均有不同程度升高(P<0.01);IL6、ICAM-1、CD62L和CXCL2 m RNA表达水平均有不同程度降低(P<0.01或P<0.05)。2动物实验结果:(1)生化指标:与假手术组相比,模型组大鼠的Scr、BUN的含量显著升高(P<0.01),IS、PCS不同程度升高(P<0.01或P<0.05);与模型组相比,各治疗组大鼠的Scr、BUN含量均有不同程度降低(P<0.01),IS、PCS的含量均有不同程度下降(P<0.01或P<0.05)。(2)病理观察:与假手术组相比,模型组大鼠出现肾小球坏死、萎缩、肾小管上皮水肿变性、肾间质中有炎细胞浸润;大鼠结肠组织存在不同程度的黏膜下层水肿、大量的炎细胞浸润,肠腺结构破坏、脱落情况;与模型组相比,各治疗组大鼠的肾脏、结肠病理损伤均有不同程度减轻。(3)免疫组化的结果表明,与假手术组相比,模型组ZO1、Claudin-1表达减少;与模型组相比,各治疗组ZO1、Claudin-1表达均有不同程度升高。(4)Western Blot检测结果表明,与假手术组相比,模型组ZO1、Claudin-1蛋白表达水平显著下降(P<0.01),COX2、TNFα、CXCL2、CD62L蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组相比,各治疗组ZO1、Claudin-1蛋白表达水平有不同程度升高(P<0.01或P<0.05),COX2、TNFα、CXCL2、CD62L蛋白表达水平均有不同程度下降(P<0.01或P<0.05)。结论(1)扶肾颗粒含药血清可提高肠上皮紧密连接蛋白及基因表达水平,降低氧化应激水平及炎症反应,降低尿素对T84细胞的损伤程度,保护肠上皮屏障。(2)扶肾颗粒可降低CKD大鼠的Scr、BUN、PCS及IS的含量,减轻CKD大鼠的肾脏和结肠病理损害,保护其肾脏、结肠的结构和功能,增强CKD大鼠肠道紧密连接,降低其体内氧化应激水平,减轻CKD大鼠肠道内炎症反应,促进肠道屏障功能修复,对CKD大鼠肠道屏障具有保护作用。(3)扶肾颗粒可改善CKD状态下的肠道屏障损伤,其作用机制与扶肾颗粒调控的IκBα/NF-κB信号通路密切相关。