背景和目的:肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)属于小RNA病毒科(Picorna viridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员[1]。EV71不仅可以使感染者出现单纯的手足口病(Hand,foot and mouth disease, HFMD)症状,还可以导致严重的中枢神经系统(CNS)疾病,从而致人死亡[2、3]。自1969年分离出世界上第一株EV71病毒以来[4],此病毒便开始在世界各地陆续出现[5-12],从开始的散在流行到后来的大规模爆发。随着各地疫情规模的不断扩大,死亡病例也逐渐增多。由于EV71病毒具有这种致死性,因此越来越多的研究者开始关注这种病毒并对其进行系统的研究。2008年亚洲地区各地出现了EV71的大规模流行[13],尤其是在中国大陆地区,几乎波及所有省份和地区。此次疫情始于3月份的安徽省阜阳市,5月初广西疾病预防控制中心(Center for Disease Control and Prevention,CDC)接到了广西区内第一批手足口病的送检标本,经检测为EV71所导致。为了对此次爆发在广西区内的手足口病进行系统的研究,我们选用广西区柳州市送检的一份死亡儿童的疱疹液标本(GX08)。通过对病毒的全基因组进行核苷酸序列测定,进一步了解EV71广西株的分子生物学性状及与其他EV71毒株的遗传进化距离。材料与方法:1.细胞培养:将柳州送检的EV71疱疹液标本接种到人横纹肌肉瘤细胞细胞(RD细胞)进行扩增,扩增之后的病毒通过细胞培养蚀斑法获得纯化,纯化后的病毒再一次扩增,以备实验所需。2.分子生物学实验:提取病毒RNA后,采用RT-PCR方法,应用自行设计的9对引物对EV71广西分离株基因组建立了覆盖全基因组的9个首尾重叠的克隆,并在此基础上对广西株全基因组(未包括多聚腺苷酸尾)进行了核苷酸序列的测定。3.生物信息学分析:参考EV71各型别的代表株以及2008年中国大陆其他地区测定的EV71病毒序列,应用Bioedit、Mega、Simplot、Pfam等生物学软件及网站对GX08的全基因组和各区段的核苷酸及氨基酸序列进行系统的分析。结果:EV71广西株基因组具有肠道病毒基因组的基本特征,整个基因组全长7405个核苷酸(nt),5’端和3’端分别为742nt和82nt的非编码区,两个非编码区间为一个6582nt长的开放阅读框,编码一个含2193个氨基酸的多聚蛋白,编码区内未见有核苷酸的插入或缺失。选用来自GenBank中已公布的不同地区和时期的28株EV71和1株CoxA16的全基因组序列来与EV71广西株进行各区段的相似性比较和进化树的构建,并进一步进行其他生物信息学的分析。30株病毒的核苷酸序列相似性比较上,GX08在所有区段均与2008年阜阳地区C4亚型分离株EU703812具有最高的相似性,分别为:全序列的98.8%、5’UTR的98.7%、VP1的99.1%、VP4的99.5%、P1的98.9%、P2的98.9%和P3的98.7%,并且GX08在各个区段的比较中均与C4亚型各株有较高的相似性,各区段总的相似性在89.1%~99.5%之间;而与B型各株以及C型内C1、C2、C3和C5各株的相似性在78.5%~87.9%和76.4%~89.5%之间。在P2和P3区段,GX08与CoxA16株U05876的核苷酸相似性高于大部分的B型以及C型毒株。在氨基酸序列的相似性比较上,GX08在VP1和P1区段与2008年深圳株FJ607334有最高的相似性,分别为99.6%和99.4%;而在P2、P3以及整个编码区,GX08与2008年阜阳地区C4亚型分离株EU703812具有最高的同源性,分别为99.4%、99.8%和99.5%;在VP4区,除了DQ341361以外,GX08与其余EV71毒株的氨基酸相似性均为98.5%。在P2和P3区段,GX08与CoxA16株U05876的氨基酸相似性高于大部分的B型以及C型毒株。选取4个区段(VP1、VP4、P1和全基因组)的核苷酸序列构建30株病毒的遗传进化树。四个树图的拓扑结构基本相同,CA16作为种间比较与EV71有最早的分化。四个树图清晰地显示出了EV71的分型。在EV71内部的进化上显示出三个不同的分支,四个树图均显示GX08处于C4亚型分支内部的最末端,与EU703812处于同一簇,进化关系很近,此分支的可信度在四个树图中均有很高的分值。结论:1.本研究首次完成广西地区EV71病毒全基因组核苷酸序列的测定。序列已提交到GenBank,登录号为GQ892830,命名为GX/LZ08-04/08/CHN。2.经序列相似性比对和进化树分析,证实EV71广西株GX08属于C基因型中的C4亚型,与2008年中国国内各地区所爆发的EV71病毒的亚型一致。遗传进化分析也发现广西株与国内2008年各地区所分离的C4亚型EV71毒株亲缘关系很近,提示它们可能起源于同一种系。3.应用基因组不同区段的序列来进行病毒的遗传进化分析,通过比较进化树的拓扑结构以及可信度,还是认为以全基因组核苷酸序列为原始数据所构建的遗传进化树是病毒分型及进化研究的最理想依据。4. GX08的全基因组序列没有发生型内重组现象。