论文部分内容阅读
目的:探讨微电流刺激对脊髓内源性神经干细胞存活、增殖、分化的具体作用效果,并探究其中的相关作用机制,为应用生物物理技术手段干预脊髓损伤后损伤脊髓结构与功能重建修复提供理论支持。方法:根据SD大鼠的脊髓直径,专门研制符合SD大鼠脊髓尺寸的可植入式微电极。选取健康普通级的SD大鼠,随机分为A组(正常组,仅切除椎板,暴露脊髓)、B组(脊髓损伤组,Allen打击法制作脊髓损伤模型后在脊髓表面固定可植入式微电极,但不施加电刺激)、C组(脊髓损伤+电刺激组,脊髓损伤后,在脊髓表面固定可植入式微电极,施加电刺激)三组,每组50,每只SD大鼠取材前5天连续行Brdu(50 mg/kg)腹腔注射,以标记脊髓内保持分化活力的细胞。对C组SD大鼠施加合适的微电流刺激后,分别在不同时间点获取A、B、C三组SD大鼠脊髓标本行检测:免疫荧光技术、激光共聚焦等技术检测各组特异性神经细胞数量、形态及分布情况;Western-Blot法、PCR法检测特异性蛋白及基因的表达情况。采用运动功能BBB评分法评估三组SD大鼠后肢运动功能的恢复情况。结果:在正常SD大鼠脊髓组织内,Nestin阳性细胞零散分布于“H”型脊髓灰质,主要集中分布于脊髓中央管周围区域,而脊髓白质区域未见Nestin阳性细胞。脊髓损伤后Nestin阳性细胞数量增加,相对密集。在脊髓损伤后3天和7天时,B、C两组与A组相比较差异具有统计学意义(p<0.05);至脊髓损伤后14天时,B组Nestin阳性细胞达到高峰,但仍低于C组(p<0.01);至脊髓损伤后21天时,B组Nestin阳性细胞数开始下降,但仍高于A组平(p<0.01),C组Nestin阳性细胞仍然呈现上升趋势,直至脊髓损伤后28天到达一个平台期后开始逐渐下降,但仍然高于A、B两组(p<0.01,p<0.05)。脊髓损伤后GFAP阳性细胞显著上升,脊髓损伤后3天时,B、C两组GFAP阳性细胞显著增多,与A组相比差异具有统计学意义(均p<0.01),B与C两组之间差异具有显著性(p<0.05);至14天时,差异更明显,B组GFAP阳性细胞达到高峰,但C组GFAP阳性细胞显著性降低,与B组相比差异具有统计学意义(p=0.00),但仍高于A组(p=0.00);至21天-28天,B组GFAP阳性细胞数仍维持在较高状态,但C组显著降低,直至28天降低至较低水平,A、C两组间差异无统计学意义(p=0.551)。脊髓损伤后3天时,B、C两组MAP-2、Olig-2阳性细胞量开始下降,A组与B、C两组相比较差异具有统计学意义(p=0.00)。术后3天,MAP-2阳性细胞数量B与C两组之间差异具有统计学意义(p<0.05);7-14天时,B组MAP-2阳性细胞量继续下降,但此时C组MAP-2阳性细胞开始上升,显著高于B组(p=0.00),但仍低于A组(均有p<0.01);至21天时,B组开始回升,C组则继续升高,直至脊髓损伤后28天相对稳定,但此时C组仍低于A组(p<0.05),但高于B组(p<0.05)。术后3天Olig-2阳性细胞数量B与C两组之间差异无统计学意义(p=0.094);至7-14天时,B组继续下降,但此时C组开始上升,显著高于B组(p=0.00),且A与C组相接近(p=0.371,p=0.057);B组在14-21天持续呈下降趋势,在21-28天时开始回升。C组在21天时超过A组(p<0.05),并维持于相对较高水平。Real-time PCR和Western-Blot结果显示:A组的Notch1、Notch3、Notch4、Hes1的基因表达水平在各个时间点无显著性改变(p>0.05);B、C组Notch1、Notch3、Notch4、Hes1的基因表达水平显著增加,在脊髓损伤后2周时达到高峰,继而下降;与B组相比,C组的Notch1、Notch3、Notch4、Hes1的基因表达水平呈下降趋势,但仍高于A组;在脊髓损伤后3天,B、C两组基因表达水平差异无统计学意义(p>0.05);1周至4周时,B、C两组间的Notch1、Notch3、Notch4、Hes1的基因表达水平开始出现差异,C组下降水平快于B组(P<0.01)。在BBB评分方面:A组BBB评分与B、C两组比较,在术后各个时间点差异均有统计学意义(p=0.00)。B、C两组SD大鼠术后均出现双侧后肢活动障碍、拖行等症状,损伤后1 d,SD大鼠后肢功能丧失,肌力下降为0,双后肢拖地爬行;术后3天B、C两组BBB评分别为(2.20±0.79)、(2.60±0.52),B、C之间差异无统计学意义(p=0.41);至术后1周,大部分动物出现下肢牵拉刺激后挛缩反应,下肢关节可有活动;B、C两组BBB评分分别为(5.00±0.67)、(5.90±1.10),差异无统计学意义(p=0.066);至术后2周,下肢功能恢复明显加快,大部分大鼠恢复排尿反射,BBB评分分别为(8.50±1.08)、(9.70±0.95),差异有统计学意义(p<0.05);术后3周时部分大鼠偶尔可短暂负重站立,BBB评分分别为(9.80±0.79)、(10.70±1.06),两组之间差异具有统计学意义(p=0.018);术后4周时大部分大鼠可短暂负重站立,BBB评分分别为(10.50±1.08)、(11.40±0.84),两组之间差异具有统计学意义(p=0.017),但两组之间差异逐渐缩小,至术后4周B组BBB评分达到一个相对稳定的平台期,C组BBB评分仍然有上升趋势,此时B、C两组BBB评分与A组之间差异均有统计学意义(p=0.00)。结论:在脊髓灰质内存在少量内源性神经干细胞;脊髓损伤后内源性神经干细胞增殖活跃,但多向星形胶质细胞分化,极少向神经元分化;微电流刺激可激活内源性神经干细胞,并可通过抑制Notch信号通路以促进内源性神经干细胞向神经元及少突胶质细胞分化,而抑制其向星形胶质细胞分化,促进损伤脊髓的自我修复。本研究为应用微电流刺激干预脊髓损伤后的修复及其相关机制的研究提供理论依据。