论文部分内容阅读
为了探讨鸡贫血病病毒(chicken anaemia virus, CAV)VP3(Apoptin)基因对人喉癌细胞Hep-2的抑制效应及其作用途径,探索Apoptin在喉癌基因治疗领域的应用。本研究以真核表达质粒pVAX1为载体,以CAV Apoptin基因为效应基因,构建的重组质粒pVAX1-Apoptin,并运用RT-PCR、western blot等方法对其在Hep-2细胞中的表达进行了检测;通过脂质体介导法将重组质粒pVAX1-Apoptin体外转染人喉癌细胞Hep-2,运用噻唑兰染色、AO/EB染色、台盼兰染色等方法,评价pVAX1-Apoptin对Hep-2细胞的抑制效应及其对线粒体功能的影响;应用DCFA、Rho123等染料结合流式细胞仪检测pVAX1-Apoptin转染Hep-2细胞后对其线粒体跨膜电位(mitochondrial trans-membrane potential, ?Ψm)和细胞内活性氧(reactive oxygen species , ROS)水平的影响;应用抗细胞色素c(cytochrome c, Cyto c)、抗Bcl-2、抗p53单克隆抗体,结合western blot检测pVAX1-Apoptin介导的Hep-2胞内Cyto c释放情况和对Bcl-2、p53含量的影响;应用Caspase-3/9检测试剂盒检测pVAX1-Apoptin对Hep-2细胞Caspase-3/9活性的影响;构建了C57BL/6小鼠荷H22肿瘤细胞模型,通过瘤内注射pVAX1-Apoptin,检测抑瘤率和生存率,探讨了其对实体肿瘤的抑制效果。结果显示,pVAX1-Apoptin转染明显抑制Hep-2肿瘤细胞生长的同时,具有下调Hep-2肿瘤细胞线粒体跨膜电位、上调Hep-2肿瘤细胞活性氧水平,促进细胞色素c释放和活化Caspase-3/9,抑制实体肿瘤生长,延长生存期等作用。根据本研究实验结果可以推断,pVAX1-Apoptin可能通过作用于线粒体,刺激肿瘤细胞线粒体产生ROS,从而激活caspase-9,进而激活caspase-3等下游凋亡因子,最终通过线粒体途径诱导细胞凋亡有效抑制肿瘤细胞,具有应用于喉癌治疗和恶性肿瘤基础研究的潜力。