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肝癌在临床中是一种常见的恶性肿瘤,具有高转移潜能。转移是导致肝癌临床复发和预后不良的重要因素。作为构成紧密连接的骨架蛋白,CLDNs在细胞中表达异常会改变紧密连接的正常结构比,进而导致细胞极性的消失、迁移及侵袭能力的增强,这个现象表明,CLDNs在肿瘤的发生发展中具有重要意义。CLDN6作为CLDNs家族的重要成员之一,其表达具有高度的组织特异性。CLDN6在乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌以及结肠癌中均为低表达,但是在肝癌中却是高表达。课题组前期工作显示,CLDN6在人肝癌组织与细胞中表达上调,并且能够提高人肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。但是,目前关于调控人肝癌细胞中CLDN6表达的机制尚不明确。MicroRNAs（miRNAs）作为一种长度很短的非编码RNA,在肿瘤发生发展过程中可以通过许多不同途径发挥作用。有研究发现,肝癌中miRNA和CLDNs之间具有相关性,miRNA可能通过靶向CLDNs,调控CLDNs的表达进而调控肝癌的生长和转移。因此,我们猜测可能存在一种能够直接靶向CLDN6的miRNAs,通过调控CLDN6的表达,从而影响肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。目的:通过生物信息学分析找到一种能够靶向CLDN6的miRNAs,并通过一系列实验证明这种miRNAs能够直接靶向CLDN6,并通过调控CLDN6的表达影响肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。方法:1.生物信息学分析预测肝癌细胞中靶基因为CLDN6的miRNAs通过4种miRNAs分析数据库预测肝癌中靶基因为CLDN6的miRNAs,应用Targetscan软件预测miRNAs与CLDN6的结合位点。2.miR-424-5p和CLDN6在人肝癌细胞中的表达情况RT-qPCR检测正常肝脏细胞及四种肝癌细胞中miR-424-5p以及CLDN6的基因表达水平。3.确认CLDN6是人肝癌细胞中miR-424-5p的靶基因3.1 miR-424-5p对于CLDN6在人肝癌细胞中表达情况的影响在人肝癌细胞中过表达miR-424-5p后通过RT-qPCR实验及Western blot实验检测CLDN6 mRNA和蛋白水平的变化。3.2双荧光素酶报告实验证实miR-424-5p和CLDN6的靶向关系确认miR-424-5p和CLDN6的结合位点,通过设计合成野生序列和突变序列,将合成的不同种序列分别插入荧光素酶报告基因载体中,在人肝癌细胞中与miR-424-5p mimic或阴性对照分别共转染。转染后通过双荧光素酶报告实验检测荧光素酶活性证实miR-424-5p与CLDN6的靶向关系。4.探讨miR-424-5p通过调控CLDN6表达影响人肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。4.1 miR-424-5p对人肝癌细胞增殖能力的影响在HepG2及Huh-7细胞中过表达miR-424-5p,通过CCK8和克隆形成实验检测miR-424-5p过表达后对人肝癌细胞增殖能力的影响。4.2 miR-424-5p对人肝癌细胞迁移及侵袭能力的影响在HepG2及Huh-7细胞中过表达miR-424-5p,通过划痕实验,Transwell迁移实验及Transwell侵袭实验检测miR-424-5p过表达后对人肝癌细胞的迁移及侵袭能力的影响。4.3 miR-424-5p对人肝癌细胞中EMT相关蛋白表达的影响在HepG2细胞中过表达miR-424-5p,通过Western blot实验检测过表达miR-424-5p对人肝癌细胞中EMT相关蛋白表达的影响。4.4功能回复实验设立 miR-424-5p mimic/vector 实验组及 miR-424-5p mimic/CLDN6 实验组进行CCK8,Transwell迁移和侵袭实验,检测同时过表达CLDN6和miR-424-5p对人肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力的影响。结果:1.生物信息学分析预测人肝癌细胞中靶基因为CLDN6的miRNAs生物信息学预测分析结果显示在人肝癌细胞中可以与CLDN6靶向结合的miRNAs 是 miR-424-5p。2.miR-424-5p和CLDN6在人肝癌细胞中的表达情况RT-qPCR实验的检测结果显示,在HepG2、Huh-7、SMMC7721以及SNU-449细胞中,miR-424-5p 的表达水平均明显下调（PHepG2＜0.0001,PSMMC7721＜0.01,PHuh-7＜0.001,PSNU-449＜0.05）,其中在HepG2和Huh-7中下调最为显著。CLDN6在四种人肝癌细胞中均高表达（PHepG2＜0.01,PSMMC7721＜0.01,PHuh-7＜0.001,PSNU-449＜0.05）,差异具有显著性。3.确认CLDN6是人肝癌细胞中miR-424-5p的靶基因3.1 miR-424-5p对CLDN6在人肝癌细胞中表达情况的影响选取miR-424-5p表达明显降低的两种细胞HepG2及Huh-7进行实验。RT-qPCR结果显示,在人肝癌细胞中,miR-424-5p mimic降低CLDN6 mRNA的水平（P＜0.01）。Western blot 结果表明,miR-424-5p mimic 实验组中 CLDN6 蛋白的表达也明显下调（PHepG2＜0.01,PHuh-7＜0.001）。3.2双荧光素酶报告实验证实miR-424-5p和CLDN6具有靶向关系构建了包含CLDN6 3’UTR的野生型（wild type,WT）及突变型（mutant type,MT）miR-424-5p结合序列以及荧光素酶的重组质粒,结果显示,同miR-424-5p nc组相比,miR-424-5p mimic+CLDN6 WT 3’UTR组的荧光素酶活性明显减弱（PHepG2＜0.05,PHuh-7＜0.001）,说明 miR-424-5p 可以通过 CLDN6 的 3’UTR 与之结合,CLDN6是miR-424-5p的直接靶基因。4.探讨miR-424-5p通过调控CLDN6表达影响人肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。4.1 miR-424-5p对人肝癌细胞增殖能力的影响CCK8结果显示,与对照组相比,过表达了 miR-424-5p的HepG2及Huh-7细胞的增殖能力明显受到了抑制,HepG2的细胞活力第3天后显著低于对照组（PDay3＜0.05,PDay4＜0.01）,Huh-7的细胞活力第2天后显著低于对照组（PDay2＜0.001,PDay3＜0.01）。克隆形成实验结果显示,过表达miR-424-5p的HepG2及Huh-7细胞的克隆形成数量明显少于对照组（PHepG2＜0.01,PHuh-7＜0.001）。这些结果表明,过表达miR-424-5p显著抑制人肝癌细胞的增殖能力。4.2 miR-424-5p对人肝癌细胞迁移及侵袭能力的影响划痕实验结果显示,与对照组比较,过表达了 miR-424-5p的HepG2及Huh-7细胞的迁移能力明显减弱,差异显著（P＜0.05）。Transwell迁移实验的结果提示,同对照组相比,过表达miR-424-5p的HepG2细胞及Huh-7细胞的迁移率显著降低（PHepG2＜0.01,PHuh-7＜0.0001）,差异具有显著性。上述结果表明,过表达miR-424-5p后,显著抑制了人肝癌细胞的迁移能力。Transwell侵袭实验结果显示,和对照组相比,过表达miR-424-5p的HepG2细胞及Huh-7细胞的侵袭能力明显减弱（PHepG2＜0.001,PHuh-7＜0.0001）,差异具有显著性。说明过表达miR-424-5p后,显著抑制了人肝癌细胞的侵袭能力。4.3 miR-424-5p对人肝癌细胞中EMT相关蛋白表达的影响Western blot实验检测结果显示,与对照组相比,HepG2细胞中E-cadherin表达增多（P＜0.01）,而 N-cadherin 与 Vimentin 的表达减少（PN-cadherin＜0.05,PVimentin＜0.01）,差异具有显著性。4.4功能回复实验设立 miR-424-5p mimic/vector 实验组以及 miR-424-5p mimic/CLDN6 实验组进行功能回复实验。CCK8实验结果表明,在过表达miR-424-5p的人肝癌细胞中同时过表达CLDN6可回复人肝癌细胞的增殖能力（PDay2＜0.001,PDay3＜0.01）。Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验结果提示,在过表达miR-424-5p的人肝癌细胞中同时过表达CLDN6可以回复人肝癌细胞的迁移及侵袭能力（P＜0.0001）。结论:1.miR-424-5p在人肝癌细胞中低表达。2.miR-424-5p 和 CLDN6 的 3’UTR 直接结合,CLDN6 是 miR-424-5p 的直接靶基因。3.miR-424-5p通过调控CLDN6的表达影响人肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。