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目的： 我们以往的研究发现，在肺癌性胸水中基因hTERC和hTERT的DNA拷贝数均增高。肿瘤中hTERT的mRNA水平增高已经得到广泛的证实，因此我们推测在肺癌性胸水中hTERC的mRNA水平同样高于良性病变胸水。近来研究发现人乳头瘤病毒(HPV)不仅与宫颈癌的发生密切相关，而且HPV感染可能是不吸烟人群特别是亚洲地区患肺癌的一个重要诱因。16型人乳头瘤病毒(HPV16)可以诱导细胞永生化，其中HPV病毒早期表达蛋白E6和E7在细胞永生化中起决定性作用，可能通过某些转录因子使端粒酶活化，其机制尚不清楚。LKB1是一种肿瘤抑制基因，在正常人多种组织中广泛表达。有研究表明，抑癌基因LKB1的缺失可以促进HPV感染患者发展为宫颈癌，而感染高危型HPV未发展为宫颈癌的患者LKB1的表达高于宫颈癌患者，那么在肺癌中是否有此现象？LKB1基因的突变缺失可以激活转录因子SP1的转录活性，因此我们猜测LKB1基因的突变缺失可能通过激活转录因子SP1而激活端粒酶活性，从而使正常细胞转变为永生化的肿瘤细胞促进肿瘤的发生。因此我们通过检测大量的临床胸水标本、在细胞系中分别转染E6和LKB1质粒以及干扰E6和SP1的表达来探讨E6和LKB1调控hTERC和hTERT的机制，E6和LKB1之间是否存在相互作用。 方法： 1、标本收集 收集中国医科大学附属第一医院2012年3月至2013年6月门诊及住院患者胸水170例，其中肺腺癌性胸水90例，肺良性病变胸水80例（炎性53例及结核性27例）。所有病例具备完整的病人资料。 2、RT-qPCR 采用TrizolTM试剂提取胸水离心后细胞沉渣或培养细胞的总RNA，利用 TaKaRa公司的PrimeSccriptTM RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒进行反转录。应用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂尽行实时定量PCR。分别扩增DVL-3、δ-catenin、LKB1、SP1、E6、E7、hTERC和hTERT，以GAPDH为内参。 3、A549细胞及H1299细胞培养 筛选肺腺癌细胞株A549细胞（E6与E7表达阳性，LKB1表达阴性）与H1299细胞（E6与E7表达阴性，LKB1表达阳性），分别应用含10％胎牛血清(GBICOInc.，NY, USA)的高糖DMEM(GBICO Inc.,NY, USA)和含10％胎牛血清(GBICOInc.，NY, USA)的1640培养基(GBICO Inc.，NY, USA)培养(37℃，5％ CO2)，贴壁生长，每2-3天胰酶消化传代一次。 4、Western blot 收集细胞，提取总蛋白，蛋白定量。收集足量目的细胞，用皮尔斯公司核浆分离试剂盒，操作按说明书严格进行，分别提取核/浆蛋白，蛋白定量。配制8％聚丙烯凝胶，每个泳道加入40ng蛋白进行电泳，电泳时浓缩胶和分离胶的电压分别为电泳后将蛋白转印到PVDF膜上，然后用5％脱脂牛奶封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗37℃孵育2小时后ECL发光 5、质粒转染 将LKB1质粒（内蒙古大学生命科学院侯鑫教授惠赠）和E6质粒（广东医学院生化和分子生物研究所唐旭东教授惠赠）导入感受态宿主细菌大肠杆菌中扩增、纯化，使用Lipofect2000转染试剂将质粒分别转染至肺癌细胞系A549与H1299中，通过Western Blot和RT-qPCR鉴定转染效果。选取干扰效果较好的E6 siRNA序列导入E6表达较高的A549细胞系;选取干扰效果较好的SP1 siRNA序列导入SP1均表达的A549细胞系和H1299细胞系，通过Western Blot和RT-qPCR鉴定转染效果。 6、统计分析 使用SPSS16.0统计软件进行结果统计。所有数据其实验最少重复3次，使用LSD-t检验对各样本均数行两两比较。P＜0.05具有统计学差异。 结果： 在170例胸水中,肺癌组（90例）DVL-3 mRNA和δ-catenin mRNA的表达明显高于良性病变组（80例），且两者具有正性相关，其联合检测对于肺癌的诊断具有重要意义。肺癌组中抑癌基因LKB1 mRNA的表达明显低于良性病变组(80例)，而SP1、hTERT及hTERC的mRNA水平在肺癌组中显著增高。在90例肺癌胸水中，LKB1的mRNA水平在E6(+)组明显低于E6(-)组，hTERT的mRNA水平在E6/E7(+)中均明显增高，而SP1及hTERC的mRNA水平在HPV16感染时虽有所增高但无统计学差异。在肺癌胸水中，LKB1表达缺失组，SP1、hTERT及hTERC的mRNA水平均增高，其中SP1差异显著(P＜0.05)。 在不表达LKB1的A549细胞中转染LKB1质粒，转染组较对照组E6、SP1、hTERT及hTERC的蛋白或mRNA表达水平均下降。在不表达E6的H1299细胞中转染E6质粒，转染组LKB1的蛋白表达和mRNA水平均下降，而SP1、hTERT及hTERC的蛋白或mRNA表达明显增加。在A549细胞中干扰E6的表达，尽管SP1下调不明显，而hTERT及hTERC的表达仍显著下调，而SP1的蛋白表达下降不明显。分别在A549细胞及H1299细胞中进行SP1的干扰，干扰组hTERT及hTERC的表达显著下降。 结论： 1.DVL-3、δ-catenin、E6、E7、LKB1、SP1、hTERT及hTERC在良恶性胸水的诊断和鉴别诊断上具有重要的临床应用价值。 2.HPV16 E6下调LKB1后，可通过介导SP1上调hTERT和hTERC的蛋白或mRNA的表达。 3.HPV16 E6上调hTERT和hTERC的表达，除了通过介导SP1外，可能还有其它转录因子参与。