【背景】缺血/再灌注损伤（ischemia reperfusion injury, I/RI）是指组织器官长时间缺血后，恢复血液供应时组织器官功能上的损伤不能得到恢复，反而被加重。许多临床案例证明仅仅缺血不足以导致组织损伤，而是在缺血一段时间后又突然恢复血供时才出现损伤。在创伤性休克、器官移植、血栓等血液循环障碍时，都会出现缺血后再灌注损伤。缺血性心脏病是全球主要死亡原因之一，严重威胁着公众健康。要挽救缺血心肌就必须及时、有效的恢复缺血心肌的血流。但是，临床发现有一部分病例在手术成功恢复缺血心肌血供后，却导致心肌缺血/再灌注（myocardialischemia/reperfusion，MI/R）损伤致使病情反而恶化，出现进行性心功能下降，甚至发生致死性心率失常。关于MI/R损伤的影响有三个方面：心肌超微结构的变化、心肌能量代谢的变化以及心功能的变化。再灌注后由于恢复供氧而产生活性氧族（reactive oxygen species, ROS）增多，钙离子超载及炎症反应等均是引起MI/R损伤的机制，并直接或间接引起心肌细胞凋亡和坏死。Notch信号途径是影响细胞命运的保守信号转导通路，决定着成年动物组织和器官正常结构和功能的维持及其受损后的修复。以哺乳动物为例，经典Notch信号通路由5种配体（Delta-like1,3,4和Jagged1，Jagged2）和4种受体（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）组成，当相邻细胞间的Notch受体和配体相互作用后，Notch受体的跨膜区依次在ADAM金属蛋白酶和具有γ分泌酶活性的Presenilin或Nicastrin的作用下从近膜处裂解，释放出Notch胞内区(Notch intracellular domain, NICD)并进入细胞核内。进入核内的NICD可通过RAM结构域与转录因子RBP-J（recombinationsignal binding protein J）相互作用，激活含有RBP-J识别位点的启动子的转录，从而调节细胞分化相关基因的表达。目前，仅有极少一部分RBP-J下游靶基因得到鉴定。最常见的下游靶基因是bHLH类转录因子，如Split家族Hairy增强子（hairy/Enhancerof split, Hes）等。在哺乳动物的四种Notch受体都需要RBP-J来介导转录激活活性。有文献显示，外界刺激使细胞产生Notch信号途径的应答，在肝脏和脑缺血性损伤中Notch信号途径都有参与。在MI/R损伤的过程时，Notch信号途径是否参与其中？Notch信号途径在此过程中起到什么作用？Notch信号途径发挥作用的具体分子机制是什么？对这些问题的研究将进一步完善MI/R损伤的分子调控理论体系，可为MI/R损伤的预防提供理论基础，更可为MI/R损伤相关的治疗提供新的视角。【目的】研究Notch信号途径在MI/R损伤中的作用，观察缺氧/复氧后Notch信号途径相关分子的变化，以及Notch信号途径是否影响ROS的生成。为探索MI/R损伤的分子调控机制，及为缺血性心脏病的防治提供一个崭新的策略和途径。【方法】1. H9C2(2-1)大鼠胚胎心肌细胞的培养应用含100ml/L胎牛血清的DMEM培养基进行培养，当细胞近汇合时，用2.5g/L胰酶消化，将H9C2(2-1)细胞按1:2～1:4传代。在实验前1d，细胞培养换为含20ml/L胎牛血清的培养基，使H9C2(2-1)细胞向心肌细胞分化。2.原代乳鼠心肌细胞的培养无菌条件下取出1～3d的SD乳鼠心脏，剪碎，加入含1.0g/L胶原酶Ⅰ的消化液，于37℃水浴3～5min，反复吹打，静置，弃去上清液。于沉淀中再加入消化液，置37℃水浴中约5min，反复吹打后，将上清移至含100ml/L胎牛血清及0.1mmol Brdu的完全培养基(含10%胎牛血清100U/ml青霉素及0.1mg/ml链霉素的DMEM)中。重复上述步骤，直至所有组织都被完全消化。离心取沉淀并重悬于完全培养基中。差速贴壁90～120min，将细胞悬液移至培养板或培养皿中，加入含0.1mmol/LBrdu的完全培养基。每24h换1次液。换液时，观察细胞形态，若由圆形变成梭形或不规则形，由静止变成有规律的收缩时进行实验。3．实验分组将心肌细胞分为两个组，即缺氧/复氧（H/R）组和常氧组。H/R组的细胞用无糖无血清DMEM培养基培养，并置于低氧罐中培养6h，随后换为正常培养基培养3h，常氧组的细胞使用含100ml/L胎牛血清的高糖DMEM培养基培养。两组又分为对照组、DMSO组及GSI（Notch信号阻断剂）组。4．体外应用GSI阻断Notch信号在心肌细胞缺氧处理前一天加GSI75μmol/L按1：3000溶于完全培养基中。观察阻断Notch信号途径对MI/R损伤的影响。5．利用Real-time PCR检测Notch信号途径相关分子mRNA的表达水平应用RNA提取试剂盒提取乳鼠原代心肌细胞总RNA，并用反转录试剂盒将之反转录为cDNA。反应体系为2×qPCR TaqMix12.5μl、10μmol/L扩增Notch1、Jagged1、Hes1基因的正反向引物序列的混合物0.5μl，对应的cDNA各1μl，补加水至25μl，并设不加模板的阴性对照（2×qPCR TaqMix12.5μl、10μmol/L扩增Notch1、Jagged1、Hes1基因的正反向引物序列的混合物0.5μl，补加水至25μl）。用荧光定量PCR仪扩增，PCR的反应条件为：95℃5min预变性后，95℃15s→60℃35s（荧光检测），共40个循环。并对PCR的产物进行了电泳分析。6. Notch信号途径相关分子的Western blot检测从培养的乳鼠原代心肌细胞中提取蛋白，测定蛋白浓度后，进行SDS-PAGE电泳并电转移至聚偏[二]氟乙烯(PVDF)膜上。用5%的脱脂奶粉封闭1h。加1:500兔抗Notch1、1:200山羊抗Hes1或1:1000小鼠抗β-Tubulin抗体，4℃孵育过夜，用TBST洗膜，再分别用1：4000的HPR标记山羊抗兔、牛抗山羊及山羊抗小鼠IgG，于37℃孵育1h。洗涤后用增强型化学发光液(ECL)显色后，采用Quantity One分析软件进行信号采集并进行灰度扫描。7.细胞凋亡的检测将H9C2(2-1)细胞接种到盖玻片上，低氧/复氧结束后，严格按照TUNEL试剂盒的使用说明进行细胞染色，并用DAPI进行细胞核染色。阳性标准为：凋亡细胞呈绿色，表示凋亡阳性细胞，蓝色为细胞核。观察凋亡细胞的个数，用400倍显微镜观察每张玻璃片中凋亡细胞的个数，每张玻片随机选取10个视野进行细胞计数，每组计数100个视野，结果以其均值表示。凋亡指数(AI)为凋亡细胞的数占细胞核总数（细胞总数）的百分比表示。染色及细胞计数均采用双盲法。8. ROS水平的荧光探针DCFH-DA检测采用胰酶消化的贴壁H9C2(2-1)细胞。将探针溶液在新的DMEM培养基中稀释到所需浓度作为染色液，以染色液更换细胞培养液，在37℃避光孵育20min（每隔5min摇动细胞）。孵育结束后，用新鲜DMEM培养基洗涤细胞。加0.5～1ml冰冷PBS的重悬细胞（5～10万个），采用流式细胞仪于488nm波长激发，测定波长大于525nm的发射光，可将细胞分成两个亚群：ROS阴性的细胞仅有很低的荧光强度；ROS阳性的细胞具有较强的荧光。9.统计学处理数据以x±s表示，用origin8软件进行统计学分析。多组间比较采用ANOVA，两组间差异比较采用组间t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。【结果】1.阻断Notch信号途径会导致MI/R损伤加重。用TUNEL染色法检测细胞凋亡水平，用LDH检测细胞损伤，体外结果显示H/R显著增加心肌细胞凋亡率和心肌损伤，应用GSI阻断Notch信号途径后心肌细胞凋亡率和损伤水平进一步增加。2.阻断Notch信号途径可使MI/R损伤中心肌细胞的ROS水平增加。用荧光探针DCFH-DA检测心肌细胞ROS水平，体外结果显示H/R使心肌细胞ROS水平显著增加，应用GSI阻断Notch信号途径后进一步促进H/R心肌细胞ROS的生成。3．MI/R损伤时Notch信号途径中各分子的基因表达反应性上调。H/R可使心肌细胞中Notch信号途径的受体基因Notch1的水平及心肌细胞中配体基因Jagged1的水平显著升高，加入GSI后，受体Notch基因和配体Jagged1基因的水平，并没有显著改变。H/R可使心肌细胞中Notch信号途径下游转录基因Hes1的水平显著升高，加入GSI后，可显著降低Hes1基因的水平。4．MI/R损伤时Notch信号途径中蛋白水平的表达反应性上调。体外结果显示H/R可显著增加NICD1和Notch信号下游转录因子Hes1的蛋白表达水平；加入GSI后，并未影响NICD1的蛋白水平，但Hes1的蛋白表达水平受到明显抑制，显著下降。5.应用H9C2(2-1)细胞分别与OP9-Dll1或OP9-GFP共培养的方法，激活Notch信号途径，荧光探针DCFH-DA检测法和细胞流示图观察心肌细胞中ROS的水平。结果显示，激活Notch信号途径组：OP9-Dll1与对照组：OP9-GFP相比较，H/R后OP9-Dll1组心肌细胞中ROS的水平显著降低，说明激活Notch信号途径可能抑制ROS的生成。6．LDH细胞活性检测结果显示心肌细胞损伤水平：H/R组细胞损伤水平明显比常氧组多。给予GSI抑制Notch信号途径后，可进一步加重H/R导致的心肌损伤；给予NAC清除ROS，H/R后细胞损伤水平显著降低。说明Notch信号途径是通过抑制ROS生成，来降低H/R后细胞损伤。总之，本实验检测了H/R心肌细胞中Notch信号途径分子表达的水平，观察了抑制Notch信号途径对Notch信号分子的表达，提示Notch信号途径在MI/R时反应性的上调，可能是细胞的代偿性保护反应。进一步检测心肌细胞凋亡水平的变化，发现H/R时可显著提高心肌细胞凋亡的水平，并在给予GSI阻断Notch信号途径后细胞凋亡的水平进一步增加，间接说明Notch信号途径可能对缺血心肌具有保护作用。进一步研究发现，给予GSI后，通过抑制Notch信号途径可增加H/R心肌细胞中ROS的生成，并导致细胞损伤。激活Notch信号途径，ROS的生成降低。给予NAC后，通过清除ROS，可减少细胞损伤。该结果说明，激活Notch信号途径，可能通过抑制ROS生成降低MI/R损伤。【结论】1. Notch信号阻断后会引起心肌缺血/再灌注损伤加重，表明Notch信号途径在心肌缺血/再灌注损伤中发挥重要调节作用。抑制Notch信号途径，其信号分子的基因和蛋白表达量在I/R后反应性上调，可能是一种细胞的代偿性保护反应。2. MI/R时Notch信号可能通过下调心肌细胞内ROS水平对抗心肌损伤。阻断Notch信号使ROS水平进一步升高，加剧对心肌细胞的损伤。3.激活Notch信号途径，ROS的生成降低。给予NAC后，通过清除ROS，可减少细胞损伤。该结果说明，激活Notch信号途径，可能通过抑制ROS生成降低MI/R损伤。