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在我国,葡萄已经成为栽培最普遍的果树之一。植物基因工程的发展为葡萄育种开辟了新的途径,高效稳定的再生体系和遗传转化体系是当前葡萄基因工程育种中最关键的问题。天冬氨酸蛋白酶是蛋白酶家族四个亚族中的一个。植物天冬氨酸蛋白酶(aspartic proteases,APs)参与不同植物器官中的蛋白质加工或降解,并参与植物衰老、抗逆反应、程序性细胞死亡及植株再生等生理过程。但是,目前关于葡萄天冬氨酸蛋白酶家族基因的研究还是空白。本研究一方面是建立了稳定、高效的葡萄胚状体再生体系,另一方面是进行了葡萄天冬氨酸蛋白酶家族基因功能研究,为葡萄抗病(逆)分子育种提供候选基因。取得以下主要结果:1.建立了9种基因型的三种外植体的胚状体发生途径的再生体系。胚性愈伤组织诱导率最高的培养基是含2.5μM 2,4-二氯苯氧乙酸,2.5μMβ-萘氧乙酸,5.0μM 4-氯吡脲,0.05%(w/v)谷氨酰胺,3.0%蔗糖,0.01%肌醇和0.7%TC琼脂的NN69培养基。先将胚性愈伤组织在MGN培养基上培养两个月后再转移到X6培养基上继续培养,能延长胚性愈伤组织的保存时间,增加原胚团的量,并减少畸形胚的发生。将体细胞胚的子叶切除后能显著提高体细胞胚的萌发率及成苗率。2.在葡萄基因组数据库中鉴定到50个天冬氨酸蛋白酶基因,其中30个含有完整的ASP结构域及DT/SG活性位点。同线性分析表明串联重复和大片段染色体复制引起葡萄AP基因家族的扩大。葡萄和拟南芥基因组的同线性分析结果发现有多个葡萄AP基因位于同线区域,表明这些基因可能起源于葡萄和拟南芥分化之前。蛋白质及外显子/内含子结构分析表明葡萄AP基因的编码序列可能发生外显子或内含子的获得或丢失以及外显子/内含子长度的多样性,这可能是染色体重排或融合的结果。采用半定量RT-PCR检测了30个葡萄AP基因在6个组织及不同胁迫和激素处理后的表达情况。结果表明有27个葡萄AP基因在至少一种组织中表达,19个Vv APs响应非生物胁迫,12个Vv APs响应白粉病的侵染,大多数Vv APs都响应SA和ABA处理。3.采用反转录RT-PCR从巨峰葡萄中克隆得到AP17基因的c DNA序列,该基因开放阅读框为1074 bp,编码357个氨基酸,Gen Bank登录号为KM210287。对过量表达Vl AP17的转基因拟南芥幼苗和成龄苗进行了干旱和盐胁迫处理,并测定了相关的生理指标,抗氧化酶的活性及胁迫相关基因的表达情况。结果表明Vl AP17可能通过保护细胞膜的完整性和增加植株的根系生长量来增强对盐和干旱胁迫的抗性,还可能参与ABA生物合成的途径或在ABA生物合成途径的上游起作用。4.采用反转录RT-PCR从中国野生毛葡萄‘商-24’中克隆得到AP13基因的c DNA序列,该基因开放阅读框长度为1500bp,编码499个氨基酸,Gen Bank登录号为KP998099。对过量表达Vq AP13的转基因拟南芥植株接种白粉菌,Pst DC3000和灰霉病,结果显示白粉病侵染后转基因拟南芥植株发病较轻,单位质量叶片上的孢子数较少,Pst DC3000侵染后转基因植株叶片发病较轻,且抗氧化酶的活性较高,活性氧积累较少。而灰霉病侵染后转基因叶片上的病斑较大,抗氧化酶活性较低,活性氧积累较多,且死细胞面积较大。对转基因和野生型叶片注射Pst DC3000,flg22和LPS,结果显示转基因叶片上积累的胼胝质较多。另外,对接种不同病原菌后的转基因植株内的抗病相关基因的表达进行了检测,结果表明Vq AP13可能通过依赖SA和JA的信号转导途径响应白粉病,Pst DC3000和灰霉病的侵染,并且可能在SA信号转导途径中起正调控作用,而在JA信号转导途径中起负调控作用。5.从中国野生毛葡萄‘商-24’的基因组中克隆得到Vq AP13基因的启动子序列,该序列长度为1550 bp,Gen Bank登录号为KP998100,其中含有两个Me JA响应元件,三个SA响应元件。将Vq AP13基因的启动子与GUS融合后瞬时转化烟草叶片,并用SA和Me JA处理,发现Vq AP13基因的启动子活性受SA和Me JA的诱导。